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【摘要】 目的 探讨三苯氧胺诱导乳腺癌细胞凋亡可能的机制。 方法 用流式细胞仪检测细胞凋亡，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞增殖活性。用RT-PCR和Western-blot检测Survivin mRNA和蛋白表达。 结果 TAM浓度在1μmol时，发挥最大的促凋亡和抑增殖活性，且Survivin mRNA蛋白表达下降最明显。 结论 三苯氧胺诱导乳腺癌细胞凋亡与Survivin有关。
【关键词】 三苯氧胺 乳腺癌 细胞凋亡 Survivin
The mechanism studies of apoptosis induced by tamoxifen in breast cancer
Li Junchuan，Xie Ping，Chen Tingxuan，et al.
Departement of Pathology，The First Pepole's Hospital of Jingzhou，Hubei434000.
【Abstract】 Objective To investigate mechanism of apoptosis induced by tamoxifen in breast cancer.Meth-ods Detecting apoptosis by flow cytometry and measuring cell proliferation activity by MTT assary in breast cancino-ma.Expression of survivin mRNA protein was evaluated by RT-PCR and western blot analysis.Results When ta-moxifen was1?mol，promoting apoptosis，inhibiting proliferation activity and survivin mRNA protein expression singnificantly decreasing was detected in the human breast carcinoma cell line.Conclusion Apoptosis induced by ta- moxifen in breast cancer has been associated with survivin playing important pole in regulation of cell cycle.
【Key words】 tamoxifen breast cancer apoptosis survivin
三苯氧胺（Tamoxifen，TAM）是非甾体抗雌激素药物，已广泛用于雌激素受体（ER）阳性的各期乳腺癌的治疗，取得了较好的疗效。最近研究表明，TAM对肿瘤细胞的生长抑制活性与细胞凋亡有关。Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成员，定位于人类染色体17q25，与细胞的凋亡和增殖有关。作为一种凋亡抑制因子，Sur-vivin是否与TAM作用机制有关呢?我们作了简要探讨。
1 材料和方法
1.1 试剂 三苯氧胺购自Sigma公司;RPMI1640，小牛血清是Hycolone产品;Trizol试剂为Gibco产品;反转录试剂盒和Taq酶为Promega产品;Survivin和β-actin引物序列由北京奥科公司合成。Survivin多克隆抗体由深圳晶美公司提供。
1.2 细胞培养 乳腺癌细胞系MCF-7在含有10%小牛血清的RPMI培养液中培养，培养条件为37℃、饱和湿度、5%CO 2 ，孵育箱内贴壁生长3～4代后，细胞长满瓶底80%～90%传代，取指数生长期的细胞进行实验。
1.3 实验分组及处理 按TAM处理浓度不同分为5组，1至5组分别为对照组，0.5μmol组，1μmol组，2.5μmol组，5μmol组。每组设3个平行样品，分别处理6h，12h，24h，然后进行相应检测。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡比率 收集处理后的细胞2×10 6 个，70%乙醇4℃固定，检测前用PBS重悬并洗涤细胞。加入100μlDNaseⅠ（1mg/ml）和100μl PI（400μg/ml），37℃孵育30min后上机检测。含有“亚二倍体”DNA的细胞被认为是凋亡细胞，结果以ModFit LT for Mac v3.0软件分析。
1.5 四甲基偶氮唑蓝（MTT）测定细胞增殖活性 将各组细胞以1×10 3 个分别接种于96孔，每孔加入MTT（10mg/ml）10μl，继续培养4h，弃去培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，酶标仪测定490nm处吸光度（A）值。计算细胞抑制率，细胞生长抑制率（IR）%=（1-A 实验组 /A 对照组 ）×100%。
1.6 RT-PCR检测Survivin mRNA的表达 用Trizol提取总RNA，逆转录成cDNA后，以β-actin为内参，进行PCR。Survivin引物序列为::正义链F:5'TTCTCAAGGACCAC-CGCATC3'，反义链R:5'AGAGGCCTCAATCCATGG3';扩增产物388bp，β-actin引物序列为:正义链F:5'CAACCTTCTACAAT-GAGCTGC3'，反义链R:5'TGGCCATCTCTTGCTCGA3'。扩增产物302bp。反应体系50μl，退火温度为57℃，30个循环。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察照相。将照片通过凝胶图像分析系统分析，PCR产物量以光密度×面积表示。最终结果以Survvin PCR产物量/β-actin产物量的比值表示。
1.7 Western blot检测Survivin蛋白的表达 用三去污剂裂解液裂解细胞，提取总蛋白。BCA法蛋白定量。取40μg蛋白质样品电泳，并电转移至PVDF膜上。封闭膜上非特异结合位点后，加入稀释度为1:200的Survivin一抗过夜。再加入1:3000的HRP标记的二抗，用ECL化学发光试剂反应，X线片暗室曝光，常规显影定影。图像分析系统分析，以相应蛋白条带的积分光密度值表示Survivin表达的相对强度。
1.8 统计学方法 采用SAS8.0软件进行统计分析，率的比较采用小样本率χ 2 检验，计量资料采用成组设计资料的t检验。
2 结果
2.1 流式细胞仪检测凋亡 TAM浓度0.5μmol时，凋亡率轻微增加。浓度1μmol时，乳腺癌细胞凋亡率达到最大，明显高于空白组（P<0.05），且随着时间的延长，凋亡率逐渐增加，G0/G1期细胞比率增加。浓度2.5μmol、5μmol时与1μmol比较无明显差异（图1）。
图1 0.5μmol、1μmol、2.5μmol TAM作用12h时的凋亡情况略
2.2 MTT试验结果 IR随着TAM浓度的增加和作用时间的延长而增加。浓度为1μmol、2.5μmol、5μmol、0.5μmol比较IR变化明显（P<0.05），而1μmol、2.5μmol、5μmol之间IR差异不显著（图2）。
图2 各组细胞生长抑制率（略）
2.3 Survivin mRNA表达情况 1μmol TAM处理癌细胞6h后，Survivin mRNA开始下降，且在12h时下降最明显。2.5μmol、5μmol浓度处理组与空白组有差异（P<0.05），但与1μmol组比较无差异（图3）。
图3 24h时各组PCR产物电泳的结果略
2.4 Survivin蛋白表达 1μmol TAM处理癌细胞6h后，Sur-vivin蛋白表达与空白组比较不明显变化;而在12h、24h时比较有差异（P<0.05）。2.5μmol、5μmol浓度处理组在6h、12h、24h时与空白组比较均有差异，（P<0.05），而各处理
图4 24h时各组蛋白质表达情况 略
组组间比较无差异（P>0.05）（图4）。
3 讨论
TAM从20世纪70年代起已作为停经前、后乳腺癌的辅助治疗广泛用于临床。其有效性通过临床对比早已显现。TAM能够显著抑制人类乳腺癌细胞MCF-7的分裂增殖，使处于G0/G1期的细胞明显增多，使肿瘤细胞停滞于G0/G1期，从而抑制了肿瘤细胞的生长。一般认为，TAM是通过和雌激素竞争与ER结合，抑制雌激素促增殖的活性，使细胞阻滞于G0/G1期，从而实现其抗肿瘤的作用 ［1］ 。而最近有研究指出:TAM除了有抗雌激素的作用外，TAM抗肿瘤机制也与增强肿瘤细胞凋亡功能密切相关 ［2］ 。我们的结果显示TAM能诱导细胞凋亡和抑制增殖，且具有时间依赖性。浓度在1μmol时，作用明显。但随着浓度的增加，其凋亡率和增殖抑制率不再增加，说明TAM浓度达到1μmol后，其作用具有饱合性。
RT-PCR和Western blot实验结果表明:TAM在mRNA和蛋白质水平能抑制Survivin的表达。1μmol TAM作用癌细胞6h后mRNA水平即下降，其蛋白表达在12h时下降明显。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族成员，与细胞的凋亡和增殖有关。Survivin在正常成人已分化的组织（胸腺、子宫内膜等少数组织除外）不表达，而在多种肿瘤组织中具有严格的细胞周期依赖性———G2/M期特异性表达 ［3～5］ 。Survivin通过直接抑制凋亡通路下游的凋亡终末效应器Caspase-3和Caspase-7活性，阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程;从而发挥抗凋亡作用 ［6］ 。survivin通过与细胞有丝分裂纺锤体的微管结合，参与对细胞基因转录的调节。Survivin与中心体共同定位于胞质;有丝分裂前期和中期，Survivin转移到核内与CENP2B共同结合在着丝粒上，有丝分裂后期，Survivin与赤道板上的纺缍体微管结合，有丝分裂末期，Survivin与形成中心体的微管束结合，分布在两个子细胞的中心体内，末期结束后Survivin被降解。Survivin在有丝分裂中充当一个动原粒相关蛋白，与其他染色体信使蛋白INCENP、Aurora2B激酶等相互作用，调节微管组织中心和卵裂沟的形成、染色体分离和胞质分裂，促进细胞的异常增殖 ［7］ 。肿瘤组织中过度表达的Survivin促使肿瘤细胞不断分裂增殖，加快肿瘤的生长。TAM下调Survivin的表达，使癌细胞抗凋亡能力下降，从而诱导凋亡 ［8］ 。
总之，三苯氧胺能诱导乳腺癌细胞凋亡和抑制其增殖，其机制与下调Survivin mRNA和蛋白表达有关，为TAM在临床进一步应用提供了理论依据。
参考文献
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作者单位:1 434000湖北省荆州市第一人民医院病理科
2 华中科技大学同济医学院病理学系
（编辑青 山）