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【摘要】 目的 探讨甲壳低聚糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响。 方法 在体外建立标准酶反应体系，分别加入6%的甲壳低聚糖50、100、150、200、250、300μl，用PNPG法测定酶活性;再建立加有200μl6%阿卡波糖的酶反应体系，测定酶活性。 结果 甲壳低聚糖对α-葡萄糖苷酶具有明显抑制作用，抑制效果接近于阿卡波糖。 结论 甲壳低聚糖可能具有阿卡波糖样的降糖机制。
【关键词】 甲壳低聚糖 α-葡萄糖苷酶 抑制作用
Experimental study on inhibition of chitooligosaccharides on a-glucosidase
Cao Zhaohui，He Zhansheng，Liu Sichun，et al.
Department of Biochemistry and Molecular Biology，Nanhua University，Hengyang421001.
【Abstract】 Objective To study the effects of Chitooligosaccharides on a-glucosidase activity.Methods An enzyme-inhibitor model was established to observe inhibition ofα-glucosidase activity by Chitooligosaccharides or acarbose.Results Chitooligosaccharides could obviously inhibitα-glucosidase activity.Conclusion This finding suggests that the hypoglycemic mechanism of Chitooligosaccharides is similar to Acarbose.
【Key words】 chitooligosaccharides α-glucosidase inhibition
甲壳低聚糖（Chitooligosaccharides）是壳聚糖（Chitosan）的降解产物，壳聚糖是由甲壳素（chitin，也称几丁质）经不同程度的脱乙酰化反应得来。甲壳低聚糖是由2～20个2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖单体组成的一类低聚糖，平均分子量在2000～10000之间。甲壳低聚糖具有调节免疫、抑制肿瘤生长、降胆固醇等生物学活性已为人们熟知，降血糖的研究目前虽有报道 ［1～2］ ，但多未能深入分析其降糖机制。甲壳低聚糖具有类似于阿卡波糖（拜糖平）的化学结构，国内外已有文献报道，阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶抑制剂 ［3］ ，它通过抑制α-葡萄糖苷酶作用而延迟葡萄糖的肠道吸收来抑制餐后血糖的上升，从而预防或延缓糖尿病的发生和发展。本实验通过在体外建立酶反应体系，观察分析甲壳低聚糖是否具有类似于阿卡波糖的降血糖机制，即对α-葡萄糖苷酶是否有抑制作用。从而为将甲壳低聚糖开发成糖尿病易感人群或患者的日常保健饮品的可行性，提供初步的实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 甲壳低聚糖，南华大学生命科学与技术学院生化教研室从壳聚糖通过H 2 O 2 氧化降解法制备，聚合度3～7的寡糖占降解产物的60%左右 ［4］ ;PNPG（4-硝基酚-α-D呋喃葡萄糖苷），德国E.Merck公司产品;α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20;α-glucosidase），Sigma公司产品;阿卡波糖（拜糖平），德国拜耳公司产品;还原型谷胱甘肽，上海化学试剂公司产品;其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 α-葡萄糖苷酶活性测定 根据Pierre等 ［5］ 的方法，以PNPG为底物，测定α-葡萄糖苷酶的活性。反应系统为:67mmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）2.4ml，1mg/ml谷胱甘肽溶液50μl，20mg/mlα-葡萄糖苷酶溶液5μl，37℃保温10min后，加入0.116mol/L PNPG溶液50ul，反应10min，用0.1mol/L Na 2 CO 3 溶液10ml终止反应，于波长400nm处测定在酶作用下释放出的对硝基酚的光吸收值。其中酶活力单位定义 ［6］ :在37℃，pH6.8条件下，1min内水解PNPG释放1μmol对硝基酚（PNP）所需的酶量。抑制剂活力单位定义:在相同条件下降低1个酶活力单位所需的抑制剂量。抑制剂活力=标准样的酶活力—加入抑制后酶活力，抑制率=（抑制剂活力/酶活力）%。
1.2.2 甲壳低聚糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响 将60mg/ml甲壳低聚糖分别取50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl加入到酶活性测定系统中，先与酶在37℃下保温10min，再加底物（PNPG）反应10min用Na 2 CO 3 溶液终止反应。在400nm下测光吸收值。
1.2.3 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响 取研磨后的阿卡波糖配制成60mg/ml的溶液。将200μl的60mg/ml阿卡波糖加入到酶活性测定系统中，先与酶在37℃下保温10min，再加底物（PNPG）反应10min，用Na 2 CO 3 溶液终止反应。在400nm下测光吸收值。
1.2.4 绘制PNP标准吸收曲线 将0.1mol/l的PNP溶液用稀释液（磷酸钾缓冲液:Na 2 CO 3 :水=5.6:43.1:1.3）以2倍体积稀释，分别在400nm处测定光吸收值，以PNP光吸收值为横坐标，PNP浓度为纵坐标，绘出标准吸收曲线，计算标准曲线方程，并对两变量的相关性进行t检验。
2 结果
2.1 绘制PNP标准曲线 将0.1mol/L PNP溶液以2倍体积稀释，在400nm处测定的光吸收值分别为0.895、0.488、0.220、0.108、0.065、0.024。据此可绘制PNP标准曲线图（图1）。经计算PNP的标准曲线方程为Y=127.5X，与李宏等 ［7］ 计算的结果一致。未加抑制剂时α-葡萄糖苷酶作用下的产物PNP在400nm处的光吸收值是0.895，根据酶活力单位的定义，对应的酶活力为114.11。
图1 PNP的标准吸收曲线略
2.2 甲壳低聚糖的量对酶活性的影响 将50、100、150、200、250、300μl甲壳低聚糖加入酶反应体系中测得反应产物的平均吸光度值分别为0.501、0.504、0.499、0.452、0.433、0.417，计算抑制率分别为44.02%、43.69%、44.24%、49.45%、51.61%、53.40%（图2）。结果显示，只需加200μl的甲壳低聚糖溶液即可产生约50%的抑制活性，且抑制作用呈一定的量效关系，表明甲壳低聚糖对α-葡萄糖苷酶活性具有较强的抑制作用。
图2 甲壳低聚糖的量对抑制效果的影响略
2.3 阿卡波糖（拜糖平）对α-葡萄糖苷酶活性的影响 将60mg/ml拜糖平溶液200μl加入酶反应体系中测得反应产物的平均吸光度值为0.415，抑制率为53.63%。而加有60mg/ml甲壳低聚糖溶液200μl的反应体系平均吸光度值为0.452，抑制率达49.45%。这表明甲壳低聚糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果接近阿卡波糖（拜糖平）。
3 讨论
α-葡萄糖苷酶在动物体内的主要作用是从碳水化合物和有关多糖的非还原端切下葡萄糖，淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖等碳水化合物的吸收利用多依赖于小肠上该酶的活性 ［8］ 。α-葡萄糖苷酶在机体的许多代谢过程中起着关键作用，并与因代谢紊乱而引发的疾病如糖尿病等有密切关系。而当α-葡萄糖苷酶活性被抑制后，肠道葡萄糖的生成速度减缓，延缓或降低了餐后高血糖的出现，从而可达到防治糖尿病及其并发症发生的目的。因此，寻找合适的抑制剂用于调控α-葡萄糖苷酶的活性是治疗糖尿病的有效途径之一。目前已用于临床治疗2型糖尿病的此类抑制剂包括德国拜耳公司生产的拜糖平，日本生产的米格列醇等。
甲壳低聚糖具有爽口的甜味，良好的水溶性，无免疫原性以及可降解性等特点且原料易得，制备方便，价格低廉。甲壳低聚糖是否具有抑制α-葡萄糖苷酶活力的作用是本实验研究的目的。我们的实验结果表明，甲壳低聚糖对α-葡萄糖苷酶活力有较强的抑制作用，抑制率与甲壳低聚糖的量呈一定的量效关系，且抑制效果接近阿卡波糖。这提示甲壳低聚糖可能具有类似于阿卡波糖样的降糖机制。本实验室正进一步对其进行动物药理实验，以期为开发利用甲壳低聚糖提供更多的实验依据。
参考文献
1 Hayashi K，Ito M.Antidiabetic action of lowmolecular weight chitosan in genetically obese diabetic KK-Ay mice.Biol Pharm Bull，2002，25（2）:188-192.
2 Lee HW，Park YS，Choi JW，et al.Antidiabetic effects of chitosan oligosaccharides in neonatal streptozotocin-induced noninsulin-de-pendent diabetes mellitus in rats.Biol Pharm Bull，2003，26（8）:1100-1103.
3 池芝盛.拜糖平的临床应用.中国糖尿病杂志，1995，3（3）:165.
4 李邦良.甲壳低聚糖的制备和分析.中国生化药物杂志，1999，20（6）:292-294.
5 Pierre C，Roland R，Tremblay D.P-Nitrophenol-α-glucopyramoside as substrate for measurement of maltase activityin human semen.J Clin Chem，1978，24（2）:208-211.
6 李英，张兰，张万山，等.α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选和初步研究.上海大学学报，2000，6（2）;129-132.
7 李宏.QHL3对α-葡萄糖苷酶活力影响及降糖机理研究.西北农业学报，2003，12（1）:103-106.
8 Asano N，Nishida M，Kizu H，et al.Homonojirimycin isomers and glyco-sides from aglaonematreubii.J Nat Prod，1997，60:98-102.
基金项目:湖南省教育厅课题资助项目（编号4-02-JY-02C399）
作者单位:1 421001湖南衡阳南华大学生物化学与分子生物学教研室
2 421001湖南衡阳南华大学医学院
（编辑罗 彬）