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首页合作平台在线期刊中华实用医药杂志2005年第5卷第5期论著

葛根素对葡萄糖诱导血管内皮细胞的内皮素转换酶-1b的影响

来源:中华实用医药杂志
摘要:【摘要】目的探讨葛根素在高浓度葡萄糖条件下对血管内皮细胞的内皮素转换酶-1b的影响。方法将人脐静脉内皮细胞株ECV304分别培养在含5。5mmol/L葡萄糖(对照组)、22mmol/L葡萄糖、22mmol/L葡萄糖+0。01g/L葛根素、22mmol/L葡萄糖+0。...

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    【摘要】 目的  探讨葛根素在高浓度葡萄糖条件下对血管内皮细胞的内皮素转换酶-1b的影响。 方法  将人脐静脉内皮细胞株ECV304分别培养在含5.5mmol/L葡萄糖(对照组)、22mmol/L葡萄糖、22mmol/L葡萄糖+0.01g/L葛根素、22mmol/L葡萄糖+0.1g/L葛根素、22mmol/L葡萄糖+1g/L葛根素的培养基中培养24h,比色法测定细胞培养上清液的乳酸脱氢酶活力、丙二醛和一氧化氮的浓度,逆转录聚合酶链反应检测细胞中内皮素转换酶-1b的mRNA。 结果  各组乳酸脱氢酶活力和一氧化氮的浓度的差异无显著性,高浓度葡萄糖组中丙二醛和内皮素转换酶-1bmRNA比对照组增高,而含不同浓度葛根素组中的丙二醛浓度和内皮素转换酶-1b mRNA比22mmol/L葡萄糖组降低,其差异有显著性。 结论  葛根素可拮抗高浓度葡萄糖对内皮细胞的损伤,并抑制内皮素转换酶-1b mRNA的表达,此变化可能与改善血管收缩平衡有关。

    【关键词】  葛根素 葡萄糖 内皮素转换酶-1 内皮细胞

    Effects of puerarin on expressions of engothelin-converting enzyme-1bmRNA induced by glucose in vascular endothelial cells

    Gui Xinchun,Yan Bingnan,Tang Chaoke,et al.

    Lianzhou Health School of Guangdong,Lianzhou513400.

    【Abstract】 Objective To investigate the effects of puerarin on expression of endothelin-converting enzyme-1bmRNA(ECE-1bmRNA)induced by high glucose in vascular endothelial cells(VEC).Methods Cultured hu-man umbilical vein endothelial cells(ECV304)were cultured with various concentration of glucose(Glu)and puerarin(Pue)(5.5mmol/L Glu、22.0mmol/L Glu、22.0mmol/L Glu+0.01g/L Pue、22.0mmol/L Glu+0.1g/L Pue、22.0mmol/LGlu+1g/L Pue)for24h.The release of lactate dehydrogenase(LDH)and maleic dialdehyde(MDA)con-tent in supernatant-conditioned media were measured by colori metric assay;The level of nitric oxide(NO)was e-valuated by nitrate reductase method;the expression of endothelin-converting enzyme-1b mRNA was determined by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results The releases of LDI and the level of NO were no differences in difference groups;The MDA contents and the expressions of ECE-1b mRNA in22.0mmol/L Glu were significant higher than that in control group;The MDA contents and the expressions of ECE-1b mRNA were significant decreased by puerarin treatment.Conclusion Puerarin has protective effect on injury and inhibit the expressions of ECE-1b mRNA on VEC induced by high glucose,which might take part in improvement of vasomo-tion.

    【Key words】 puerarin glucose endothelin-converting enzyme endothelial cells

    血管内皮受损被认为是糖尿病血管病变(diabetic an-giopathy,DA)发生的始动环节。高血糖是已公认的损伤因素和致糖尿病血管病变的危险因素。但糖尿病患者血糖升高导致血管内皮损伤和血管病变的发生、发展的机制仍然不清。内皮素转换酶(endothelin-converting enzyme-1,ECE-1)是内皮素(endothelin-1,ET-1)生物合成的关键酶,有ECE-1a、ECE-1b、ECE-1c、ECE-1d四种异构体,其异构体ECE-1b能调节其它异构体的定位和活性 [1] ,在ECE-1作用中ECE-1b处于重要地位。ET-1是目前所知作用最强的长效血管收缩肽,在与血管病变有关的疾病的发生、发展中发挥重要作用。有文献报道,在糖尿病大血管病变患者的血液白细胞中内皮素转换酶的表达和血浆中ET-1的生成高于正常人 [2] ,证实内皮素转换酶和ET-1参与了糖尿病血管病变的病理过程。葛根素(puerarin,Pue)属植物葛根异黄酮的主要有效成分之一,研究发现,葛根素可抗血管内皮细胞凋亡 [3] ,减轻缺氧产生的自由基损害 [4] ,通过促进一氧化氮的释放,抑制内皮素的生成,保护高血压患者血管内皮的舒缩平衡 [5] ,临床研究发现,葛根素有较缓和的降低血糖的作用 [6] 。本实验旨在研究葛根素对高浓度葡萄糖条件下血管内皮细胞的内皮素转换酶-1b的表达及可能的机制。

    1 材料和方法

    1.1 仪器 FLS-IC风淋室,净化工作台(苏州吴净空调净化有限公司),CO 2 培养箱(Shedon Manufacturing Inc,USA),倒置相差显微镜(OLYMPS,Japan),ELX800Universal Mi-croplate Reader(Bio-Tek Mstruments Inc,USA),722光栅分光光度计(上海分析仪器厂),Effendorf Gentrifuge5810R(Ef-fendorf AG22331Hamburg,Germany),核酸蛋白分析仪(DU640Spec trophotometer Beckman Coulter,USA),PTC-100 TM  Peltier Thermal Cycler(MJ Research,USA),DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂),Alphalmager  TM 2200图像分析系统(Alpha Innotech Corporation,USA)。

    1.2 试剂 M199培养基(Hyclone),胎牛血清(Tianjin,H&Y Bio Co),D—葡萄糖(Glucose分析纯,汕头市光华化学厂),一氧化氮检测试剂盒,丙二醛检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),cDNA第一链合成试剂盒(BBI,Canada),Trizol,dNTP(上海生工生物工程技术服务有限公司),Taq聚合酶,100bp DNA Marker(华美生物工程公司)。葛根素注射液(海南斯达制药有限公司,纯度98%,100mg/支,国药准字H20023176)。

    1.3 细胞培养和实验分组 人脐静脉内皮细胞株ECV304,购自武汉大学中国典型生物保藏中心。用含10%胎牛血清的M199培养基培养,同时加入100U/L链霉素和100U/L青霉素,在37℃、5%CO 2 培养箱中培养,用0.125%胰蛋白进行消化传代。在每次实验中,待细胞融合前用无血清的M199培养24h进行同步化处理,在换条件培养基前,用台盼蓝染色,判断细胞活性,保证实验所用细胞的活细胞数占细胞总数的97%以上,再换用含10%胎牛血清的不同浓度葡萄糖的M199条件培养基。实验分组:对照组(5.5mmol/L葡萄糖),处理组1(22mmol/L葡萄糖),处理组2(22mmol/L葡萄糖+0.01g/L葛根素),处理组3(22mmol/L葡萄糖+0.1g/L葛根素),处理组4(22mmol/L葡萄糖+1g/L葛根素)。

    1.4 细胞培养上清液中乳酸脱氢酶和丙二醛浓度的测定 将细胞制成密度1×10 8 个/L的细胞悬液,接种在24孔培养板中(600μl/孔)进行培养,待细胞融合后按(1.3)中所述步骤处理,培养24h,取上清液测定乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase LDH)和丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)含量,LDH浓度应用全自动生化分析仪(HITACH717)测定,MDA测定步骤按试剂盒操作说明书进行,用722型分光光度计于532nm波长测定其吸光度值(A)。根据公式:MDA(μmol/L)=测定管吸光度-测定空白管吸光度标准管吸光度-标准空白管吸光度×标准品浓度×样品稀释倍数计算出各组的MDA含量。

    1.5 比色法测定细胞培养上清液一氧化氮的浓度 将细胞制成密度1×10 8 个/L的细胞悬液,接种在24孔培养板中(600μL/孔)进行培养,待细胞融合后按(1.3)中所述步骤处理,培养24h,取上清液测定一氧化氮(Nitric Oxide,NO)含量,测定步骤按一氧化氮试剂盒操作说明书(硝酸还原酶法)进行。最后用酶联免疫仪于550nm波长测定一氧化氮吸光度值(A)。根据公式:NO(μmol/L)=样品管吸光度-空白管吸光度标准管吸光度-空白管吸光度×标准品浓度×样品稀释倍数换算出各组的NO浓度。

    1.6逆转录-聚合酶链反应法检测内皮素转换酶-1b的表达1.6.1 引物设计 ECE-1引物参照文献 [7] ,ECE-1逆转录特异性引物:antisense5′-CCACAG GCGTAGCTGAAGAAG-3′,ECE-1b:sense5′-CCCTGCTGTCGGCGCTGGGG-3′,antisense5′-GAAGAATCAGGCAGGGGTC-3′,扩增长度为 347bp;GAPDH引物:sense5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′,antisense5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′,扩增长度为697bp,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.6.2 逆转录-聚合酶链反应 细胞以5×10 8 个/L的密度接种于75cm 2 的培养瓶,待细胞融合后按(1)中所述步骤处理,培养24h。培养终止时,从CO 2 培养箱中取出培养瓶,PBS(NaCl137mmol/L;KCl2.7mmol/L;Na 2 HPO 4 ·H 2 O8.1mmol/L;KH 2 PO 4 1.5mmol/L;pH7.4)洗涤2次,直接加Trizol提取RNA,用核酸蛋白分析仪测量总RNA纯度和浓度,用特异性引物逆转录成cDNA;再进行PCR扩增,50μL反应体系(10×buffer5μL,25mmol/LMgCl 2 3μL,10mmol/L dNTP1μL,12.5μmol/L上下引物各1μL,cDNA2μL,ddH 2 O36.5μL,5U/μL Taq polymerase0.5μL),94℃预变性3min,然后94℃变性40s,68℃退火20s,72℃延伸20s,35个循环,72℃延伸5min,ECE-1b和GAPDH分管同时扩增,PCR产物各取相同体积混合在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳,用Alphal-mager  TM 2200图像分析系统对其进行光密度测定,以AVG  ECE-1b /AVG  GAPDH 进行半定量分析。

    1.7 统计学处理 所有实验结果以ˉx±s表示,处理组间统计学差异显著性用SPSS11.0统计软件作单因素方差分析和相关性检验,P<0.05表示统计学上差异有显著性。

    2 结果

    2.1 葛根素对高糖损伤的内皮细胞乳酸脱氢酶和丙二醛含量的影响 两种浓度的葡萄糖孵育的内皮细胞培养液中LDH含量分别为202.7±4.3、192.0±11.3IU/L,两组之间的差异无显著性(P>0.05),MDA浓度从1.81±0.04μmol/L增至3.37±0.14μmol/L(P<0.01),说明高糖可能通过增强脂质过氧化作用而损伤内皮细胞,但高糖对细胞的损伤不是急性毒作用;在22mmol/L葡萄糖组中加入含有0.01、0.1、1g/L葛根素后,LDH浓度由(192.0±11.3)IU/L分别变成204.5±10.1、207.5±5.9、214.7±6.0IU/L(P>0.05),而MDA的浓度由3.37±0.14μmol/L分别降至2.15±0.07、1.81±1.06、1.69±0.12μmol/L(P<0.01)(表1),说明葛根素对内皮细胞也不造成急性损伤,可能通过降低脂质过氧化作用而保护内皮细胞。

    表1 葛根素对高糖损伤的内皮细胞LDH浓度和MDA含量的影响 (略)注:与对照组比较, a P>0.05, c P<0.01;与22mmol/L葡萄糖组比较, b P>0.05, d P<0.01

    2.2 葛根素对高糖损伤的内皮细胞生成一氧化氮的影响 两种浓度的葡萄糖孵育内皮细胞,血管内皮细胞培养上清液NO的浓度由67.4±10.3μmol/L增至91.6±10.3μmol/L(P<0.01);在22mmol/L葡萄糖组中加入含有0.01、0.1、1g/L葛根素后,NO的浓度由91.6±9.3μmol/L分别增加为99.6±8.7、97.7±3.3、95.4±5.8μmol/L(P>0.05)(表2),说明高糖可促进内皮细胞NO的生成,葛根素并不增加高糖条件下内皮细胞NO的生成。

    表2 葛根素对高糖损伤的内皮细胞上清液一氧化氮浓度的影响 (略)注:与对照组比较, a P<0.01;与22mmol/L葡萄糖组比较, b P>0.05

    2.3 葛根素对高糖损伤的内皮细胞ECE-1b mRNA表达的影响 用核酸蛋白分析仪测定RNA的A260和A280值,其比值均在1.8~2.0之间,提示,内皮细胞的RNA提取的纯度符合逆转录的要求。葡萄糖孵育内皮细胞24h,其ECE-1b mRNA表达增加,由0.67±0.19升至1.21±0.14(P<0.01)。在22mmol/L葡萄糖组中加入含有0.01、0.1、1g/L葛根素后,ECE-1b mRNA表达降低,分别为0.60±0.17、0.53±0.12、0.47±0.08(P<0.01)(图1),说明高糖可促进内皮细胞ECE-1b mRNA的表达,而葛根素则降低高糖条件下内皮细胞中ECE-1b mRNA的表达。

    图1 葛根素对高糖损伤的内皮细胞(略)

    3 讨论

    糖尿病血管病变是糖尿病并发症的主要表现,高血糖是各型糖尿病的共同特征,也是糖尿病血管病变的危险因子。本实验通过体外孵育血管内皮细胞,其乳酸脱氢酶含量检测结果,说明葡萄糖损伤血管内皮细胞不是急性毒作用。葛根素在高糖条件下对乳酸脱氢酶的含量无影响,说 明葛根素也不对内皮细胞造成急性损伤。一氧化氮是心血管系统一个重要、有效的调节因子,是最有效的内源性血管舒张因子,有调节血管张力、血压及细胞间相互作用,抑制血小板凝集、白细胞粘附、细胞迁移和增殖及血管内皮保护等作用。丙二醛是机体产生氧自由基,引发脂质过氧化作用而形成的脂质过氧化物,丙二醛的含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度,它的高低可间接反映机体细胞中氧自由基生成的多少及受氧自由基攻击的严重程度,也间接反映出细胞损伤的程度。当血管内皮受损影响一氧化氮的释放和氧自由基的生成时将导致内皮功能障碍。有关糖尿病中NO的代谢一直存在争论。有文献报道,长时间高糖孵育人冠状动脉内皮细胞可抑制eNOS和NO的生成 [8] 。近来研究证实 [9,10] ,高浓度葡萄糖能使内皮细胞一氧化氮合酶的活性增强和NO的生成增加,但超氧阴离子(O 2 )产生也同时增加,自由基O 2 可灭活NO,使NO的生物利用率降低,失去舒张血管的活性。本实验结果发现细胞培养液中NO和丙二醛的含量随葡萄糖浓度升高而增加,证实高糖促进内皮细胞NO的生成,但受氧自由基攻击的程度增高,可能降低了NO的生理作用。在高糖条件下,葛根素虽然不能使NO的浓度出现变化,但氧自由基生成减少,故可能实际增加了NO的生物利用率。由于葛根素可抑制丙二醛的生成,说明葛根素可能是通过降低脂质过氧化物生成而保护内皮细胞。ECE-1是一种膜结合Ⅱ型金属蛋白酶,主要分布于心血管系统,由内皮细胞合成,其表达、活性与内皮功能关系密切,由于其异构体ECE-1b在ECE-1的作用中处于重要地位 [1] ,在由bigET剪切成具有生物活性的ET-1中ECE-1b也可能起关键调控作用。ET-1是一种强烈而持久的血管收缩肽,主要由血管内皮细胞合成,通过与相应的受体结合而起作用,ET-1的增加能加速心血管疾病和血管痉挛的病理进程。在维持血管稳态中,舒张因子NO与收缩肽ET-1构成一对拮抗因素,共同调节血管的活性,当内皮受损引起内皮功能障碍时,这种平衡机制受到破坏,有研究证实,NO浓度的增高可抑制ET-1的生成 [11] ,ET-1也可负性调节内皮NO的释放 [12] ,说明ET-1与NO存在反馈调节作用。又有文献报道,ECE-1mRNA表达与蛋白质水平相一致 [13] ,ECE-1mRNA与ET-1也呈一致变化 [14] 。说明ECE-1mRNA表达增加,ET-1的生成也相应增多。Masatsugu等研究发现,低切应力使ECE-1mRNA在血管内皮细胞的表达受抑制,缺血、缺氧、缓激肽、血管紧张素Ⅱ的增加可引起ECE-1mRNA表达增加 [14] ,在人的动脉粥样硬化中ECE-1的表达也增加 [15] 。本实验通过RT-PCR检测细胞中ECE-1b mRNA,发现高浓度葡萄糖促进ECE-1bmRNA的表达。高浓度葡萄糖中ECE-1b mRNA的表达增高,就可能引起ET-1增高而导致ET/NO平衡失调,其结果使内皮功能受损,引起血管病变。在高糖条件下加入葛根素后,发现ECE-1bmRNA表达减少,说明葛根素可降低ECE-1bmRNA表达,从而可降低ET-1的生成,使ET/NO平衡趋向平衡。

    综上所述,体外培养的血管内皮细胞在高浓度葡萄糖条件下可使脂质过氧化作用增强,使一氧化氮生物利用率降低,ECE-1bmRNA增加,导致ET-1/NO的平衡失调,引起内皮功能障碍;葛根素可拮抗高糖对内皮细胞的损伤,通过降低脂质过氧化作用,抑制ECE-1bmRNA的表达,增加一氧化氮生物利用率降低,使ET/NO的平衡失调得以纠正,从而保护内皮细胞,这可能是葛根素保护内皮细胞的作用机制之一。

    参考文献

    1 Muller L,Barret A,Etienne E,et al.Heterodimerization of endothelin converting enzyme-1isoforms regulates the subcellular distribution of this metallorotease.J Biol Chem,2003,278(1):545-55.

    2 郭立新,汪恕萍,钱庆文.内皮素转换酶—内皮素系统与2型糖尿病大血管病变关系的研究.中华内分泌代谢杂志,2002,18(1):20-23.

    3 Shi RL,Zhang JJ.Protective effect of puerarin on vascular endothelial cell apoptosis induced by chemical hypoxia in vitro.Acta Pharm Sin,2003,38(2):103-107.

    4 朱智彤,姚智,李会强.葛根素对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧时脂质过氧化损伤的保护作用.中草药,2002,33(4):343-345.

    5 黄兆铨,叶武,陈申杰,等.葛根素对高血压患者血浆内皮素和一氧化氮的影响.中国现代应用药学杂志,1997,16(3):13-15.

    6 任平,胡惠君,张瑞.葛根素治疗糖尿病视网膜病变的疗效观察.中国中西医结合杂志,2000,20(8):574-576.

    7 Valdenaire O,Lepailleur-Enouf D,Egidy G,et al.Afourth isoform of endothelin-converting enzyme(ECE-1)is generated from an addi-tional promoter.Eur J Biochem,1999,264(2):341-349.

    8 Yao Xian Ding,Nosratola D Vaziri,Richard Coulson.Effects of simu-lated hyperglycemia,insulin,and glucagon on endothelial nitric oxide synthase expression.Am J Physiol Endocrinol Metab,2000,279(1):E11-E17.

    9 Graier WF,Posch K,Wascher TC,et al.Role of superoxide anions in changes of endothelial vasoactive response during acute hyperglycemia.Horm Metab Res,1997,29(12):622-626.

    10 E1-Remessy AB,Behzadian MA,Abou-Mohamed G,et al.Experi-mental diabetes causes breakdown of the blood-retina barrier by a mechanism involving tyrosine nitration and increases in expression of vascular endothelial growth factor and urokinase plasminogen activator receptor.Am J Pathol,2003,162(6):1995-2004.

    11 Boulanger C,Luscher TF.Release of endothelin from the porcine aor-ta;inhibition by endothelium-derived nitric oxide.J Clin invest,1990,85(2):587-590.

    12 Ikeda U,Yumamoto K,Maeda Y,et al.Endothelin-1inhibits nitric oxide synthesis in vascular smooth muscle cells.Hypertension,1997,29(1):65-69.

    13 North P,Bohle RM,Corvol P,et al.Cellular distribution of endotheli-um converting enzyme-1in human tissues.J Histochem Cytochem,1999,47(4):447-461.

    14 Masatsugu K,Iton H,Chun TH,et al.Physiologic shear stress sup-presses endothelin-converting enzyme-1expression in vascular en-dothelial cells.J Cardiovasc Pharamcol,1998,31(suppl1):s42-45.15 Minamino T,Kurihara H,Takahashi M,et al.Endothelin-converting enzyme expression in the rat vascular injury model and human coronary atherosclerosis.Circulation,1997,95(1):221-230.

    (编辑罗 彬)

    作者单位:513400广东省连州卫校
    421001湖南衡阳南华大学生物化学与分子生物学教研室

作者: 桂新春颜冰楠唐朝克刘宗汉 2005-8-4
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