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【摘要】 目的 探讨Fas/FasL基因蛋白在胃癌发生发展中的作用。 方法 应用免疫组化，特定组织蛋白提取及West-ern印迹杂交技术，对20例正常胃黏膜，22例癌前病变和35例胃癌组织中Fas/FasL的表达情况加以分析。 结果 正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织的Fas阳性率分别为89%、49%、38%;FasL的阳性率分别为18%、26%、45%。Western印迹杂交显示:胃癌细胞产生的Fas蛋白以分子量30kDa的可溶型Fas（sFas）为主，伴少量的43kDa膜型Fas（mFas）。 结论 Fas在正常胃黏膜和癌前病变、胃癌组织中的表达强度差异有显著性（P<0.05）;FasL在胃癌组织和正常胃黏膜、癌前病变中的表达强度差异有显著性（P<0.05）。
【关键词】 胃癌 Fas/FasL 基因表达 免疫逃逸 细胞凋亡
Expression of soluble Fas/FasL in human gastric carcinogenesis and its significance
Gang Yan，Zhu Xiaomin，Fan Yeming
Shenyang Medical College，Shenyang110034.
【Abstract】 Objective To investigate the possible role of Fas，FasL in Human Gastric Carcinogenesis.Meth-ods The expression of Fas and FasL protein was examined by immunohistochemistry staining，protein extraction and Western blot hybridization.Results The positive rates of Fas in normal epithelial cells，dysplastic cells and carcino-ma cells were89%，49%and38%，respectively.The positive rates of FasL in normal epithelial cells，dysplastic cells and carcinoma cells were18%，26%and45%，respectively.The show of the results of Western-blotting:the MW of Fas is30kDa，and the style of Fas is soluble Fas（sFas）.Conclusion Fas expression is significantly different between normal epithelial cells and dysplastic cells，carcinoma cells（P<0.05）.FasL expression is significantly dif-ferent between carcinoma cells and normal epithelial cells，dysplastic cells（P<0.05）.
【Key words】 gastric carcinoma Fas/Fasl genesis expression immunologic escape apoptosis
胃癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一，目前其发病机制尚不十分清楚。Fas（CD95/APO-1），是肿瘤坏死因子（TNF）—神经生长因子（NGF）受体超家族成员，它通过与其配体（Fasligand，FasL）相互作用，调控细胞的生存和凋亡 ［1］ 。近年来的研究表明:Fas/FasL系统的异常表达，不仅参与了胃癌发生过程中细胞凋亡异常的调节，而且与胃上皮细胞癌变及免疫逃逸有关 ［2］ 。通过检测正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织Fas、FasL的表达，以期探讨其在胃癌发生、发展中的作用。
1 材料和方法
1.1 组织来源 20例正常胃黏膜、22例癌前病变和35例胃癌组织（人正常胃黏膜和胃癌手术切除）标本选自本室与中国医科大学附属第一医院肿瘤外科共建瘤库。标本在术后2h内获取，液氮速冻后，-70℃保存。
1.2 主要试剂 兔抗人Fas、FasL抗体（Sant Cruz，USA）购自北京中山生物技术公司。增强化学荧光蛋白检测（ECL）试剂盒系英国Ameshame公司产品。ABC试剂盒为美国Vector公司产品。
1.3 方法
1.3.1 冰冻组织切片 将冰冻切片机（Leica1800型）的操作箱用100%乙醇擦洗数次，以灭活蛋白酶;温度降至-20℃左右，然后按常规方法做以上组织的冰冻切片。
1.3.2 免疫组织化学染色 将上述切片做HE染色，组织病理学观察，选择病变典型的切片用冷丙酮固定，-20℃保存，用于免疫组织化学染色。抗Fas、FasL抗体的工作浓度均为1:100。以食道鳞状上皮为阳性对照。ABC免疫组织化学染色的步骤按文献 ［3］ 所述方法进行。
1.3.3 特定组织的蛋白提取 冰冻组织的连续切片，HE染色，组织病理学观察。若有多种组织存在，则按本研究室建立的特定组织选择法 ［4］ 进行蛋白提取。选择切片总体积约2mm×2mm×2mm，立即用加样器吸头将其移至含50μl2×laemmli SDS sample buffer，超声破碎，加热5min，15000r/min离心5min，取上清，用紫外分光光度计进行蛋白浓度测定，然后调整浓度至4g/L，-70℃保存备用。
1.3.4 蛋白分析 取100μg蛋白样本，在10%SDS-PAGE中电泳分离，蛋白按常规行电转移，恒流80mA，过夜。固相支持物为硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉（DIFCO laboratories，USA），0.5%Tween-20封闭45min，以稀释度为1:500的Fas、FasL抗体与膜上靶蛋白孵育45min。辣根过氧化物酶偶联的猪抗兔抗体（Dako，Denmark）作用后，用ECL荧光显色系统曝光显色。
1.3.5 统计学分析 应用计算机将数据进行χ 2 检验。
2 结果
免疫组织化学染色的结果显示:Fas在正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织的阳性率分别为89%、49%、38%，Fas在正常胃黏膜的表达显著高于癌前病变和胃癌组织（P<0.05）;FasL在正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织阳性率分别为18%、26%、45%，FasL在胃癌组织中的表达显著高于正常胃黏膜和癌前病变（P<0.05）。Fas的表达部位基本以细胞浆为主，表现为细胞浆呈棕黄色染色颗粒。Western印迹杂交显示:胃癌细胞产生的Fas蛋白以分子量30kDa的可溶型Fas（sFas）为主，伴少量的43kDa膜型Fas（mFas）。
3 讨论
恶性肿瘤的发生发展是一个多阶段的过程，一般表现为正常上皮、不典型增生、原位癌、浸润癌，同时肿瘤的发生是多基因变异积累的过程。近年研究发现，细胞凋亡的抑制在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。由Fas/FasL系统及其细胞内信号传导分子构成了细胞凋亡的重要通路，在此通路中任一环节的缺失都可导致癌细胞逃逸细胞凋亡，从而实现无限增殖 ［5］ 。我们的实验结果表明:癌前病变、胃癌组织细胞Fas阳性表达率显著低于正常胃黏膜，提示胃癌细胞Fas下调;癌前病变、胃癌组织细胞FasL阳性表达率显著高于正常胃黏膜，提示胃癌细胞FasL上调。因此证实了胃癌组织细胞中存在Fas/FasL系统平衡失调，导致Fas/FasL系统介导的细胞凋亡途径发生异常，可能是胃黏膜癌变过程中细胞凋亡抑制的重要机制之一 ［6］ 。另外，Western印迹杂交显示:胃癌细胞产生的Fas蛋白以分子量30kDa的可溶型Fas（sFas）为主，伴少量的43kDa膜型Fas（mFas）。胃癌细胞中缺乏膜型Fas的表达意味着将不能与FasL或其重组体相结合触发凋亡。这提示:胃癌细胞可能通过大量分泌sFas来封闭细胞外基质中以及免疫活性细胞表达的FasL，以阻止后者与自身含膜内死亡区域（death domain，DD）的mFas接触，从而使胃癌细胞获得免疫逃逸能力，使胃癌细胞得以持续增殖 ［7］ 。本研究还发现Fas在胃癌发生发展各阶段中均有表达，但在表达程度上存在一定差异，即癌前病变、胃癌组织Fas阳性表达率显著低于正常胃黏膜，表明Fas表达异常可能在胃癌发生过程中起一定作用。而癌前病变和胃癌组织黏膜间的Fas表达差异无显著性（P>0.05），说明Fas的出现很可能是各类胃癌及癌前病变的重要生物学特性之一。因此，进一步对Fas/FasL的表达、功能及其可调性的分子机制的研究对胃癌的早期诊断和预后判断及基因治疗等方面具有重要意义。
参考文献
1 Nagata S，Goldstein P.The Fas death factor.Science，1995，267:1449-1456.
2 Cascino I，Fincci G，Papoff G，et al.Three functional soluble forms of the human apoptosis inducing Fas molecule are produced by alternative splicing.J Immunology，1995，154:2706-2713.
3 Li H，Hamou MF，de Tribolet N，et al.Variant CD44adhesion molecules are expressed in human brain metastases but not in glioblastomas.Cancer Res，1993，53:5345-5349.
4 岩，刘宁，刘佳，等.冰冻组织特定区域的RNA快速提取及其RT-PCR分析.中华医学遗传学杂志，2000，17（1）:47-50.
5 王成龙，谭家麟.胃癌发生发展中Fas，FasL和Bcl-2的表达.中国肿瘤，2001，10（1）:46-47.
6 李昭辉，王占民，赵志伦，等.Fas，Fas配体和IFN-r在胃癌中的表达.北京大学学报（医学版），2003，35（4）:386-388.
7 Midis GP，Shen Y，Owen-Schaub LB.Elevated soluble Fas（sFas）level in nonhematopoietic human malignancy.Cancer Res，1996，56:3870-3874.
（编辑罗 彬）
作者单位:110034沈阳医学院医学基础部生物化学教研室（ △ 微生物学教研室）