活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用

    【摘要】 目的  探讨活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用。 方法  体外培养人脐静脉内皮细胞株（ECV304），实验分为AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组。采用改良MTT法、Fenton反应和硝酸酶还原法分别观察AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组的ECV304细胞的增殖率和细胞产生ROS（·OH）的量。 结果  一定浓度的AngⅡ（0.03125～1μmol/L）作用12h时ECV304细胞增殖率增加，明显高于正常对照组（P<0.05）;AngⅡ可诱导ECV304细胞产生ROS（·OH），ROS（·OH）的含量与ECV304细胞增殖率呈显著负相关;10mmol/L NAC可抑制1μmol/L AngⅡ对ECV304细胞的增殖作用，与正常对照组相比差异无显著性（P>0.05）。 结论  AngⅡ可诱导ECV304细胞产生ROS（·OH），ROS（·OH）含量与AngⅡ呈时间和剂量依赖性;NAC可抑制AngⅡ对ECV304细胞的增殖作用，这可能与减少ROS（·OH）的含量有关;ROS（·OH）可能是AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖的主要信号转导分子之一。

    【关键词】  N-乙酰半胱氨酸 血管紧张素Ⅱ 活性氧 ECV304细胞 增殖

    Role of reactive oxygen species in the proliferation of ECV304 induced by AngⅡ

    Zhang Xuan，Xie Lixia，Yao Shuming，et al.

    Yunnan Phamacological Laboratory of Natural Products，Kunming Medical College，Kunming，Yunnan650031.

    【Abstract】 Objective To explore the role of reactive oxygen species in the proliferation of ECV304induced by AngⅡ.Methods The lines of human umbilical vein endothelial cell（ECV304）cultured in vivo were divided into three groups which were treated by AngⅡ，AngⅡ+N-acetyl-L-cysteine（NAC），and normal culture medium.First we observed the proliferous effect of ECV304induced by AngⅡat different concentration with improved MTT and microscope.Then the contents of ROS（·OH）in three groups were detected by spectrophotometer.Results ECV304incubated with AngⅡ（0.03125～1μmol/L）for12hours increase the proliferation rate（P<0.05vs con-trol group）;It is significant that the negative correlation between proliferation rate and the content of ROS（·OH）;NAC（10mmol/L）can inhibit the proliferation of ECV304induced by AngⅡ（P>0.05vs control group）.Conclusion ECV304induced by AngⅡcan produce ROS（·OH），and the contents of ROS（·OH）increase with the prolongation of time and the enlargement of dose;Antioxidant NAC can inhibit the proliferation of ECV304induced by AngⅡ，this ef-fect may be related with reducing the content of ROS（·OH）;ROS（·OH）may be one of the major mocleculars which play an important role in the signal transduction of ECV304proliferation.

    【Key words】 NAC AngⅡ ROS ECV304 proliferation

    血管内皮是心血管疾病危险因子的靶点，其功能障碍构成许多心血管疾病的病理基础。目前认为血管自稳态的调节取决于血管内皮自身的氧化还原状态 ［1，2］ 。大量研究表明，氧化应激产生的各种活性氧（reactive oxygen species，ROS）对血管内皮具有细胞毒性作用，是许多心血管疾病发生的重要机制 ［3，4］ 。然而，新近文献报道氧化应激产生的ROS在一定量时，可作为血管内皮信号转导分子，参与调节细胞功能 ［5］ 。本研究以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作为血管氧化应激的诱导剂，观察N-乙酰半胱氨酸（NAC）对人脐静脉内皮细胞株（ECV304）增殖作用的影响，探讨活性氧在血管紧张素Ⅱ诱导ECV304细胞增殖中的作用，为心血管疾病的防治提供新的理论依据，启示新药研发和应用的新途径。
   
    1 材料与方法

    1.1 材料 ECV304（人脐静脉内皮细胞株）购自中国科学院上海药物研究所;AngⅡ、NAC和MTT（批号9710）购自Sigma公司;特级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所（批号20020114）;·OH测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号20030625）。

    1.2 方法

    1.2.1 实验分组 （1）AngⅡ处理组:a.不同作用时间（4h、12h和24h）;b.不同浓度（AngⅡ终浓度分别为，0.03125μmol/L、0.0625μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L）;（2）NAC干预组:AngⅡ1μmol/L+NAC10mmol/L;（3）正常对照组:加入等量完全培养基。

    1.2.2 ECV304细胞传代培养 ECV304细胞在含20%小牛血清的RPMI1640完全培养基中，37℃、5%CO 2 、95%空气的培养箱中培养。台盼蓝染色后计算细胞存活率（Via=99%），调整细胞悬液浓度为1×10 6 个细胞/ml备用。

    1.2.3 改良MTT法测定ECV304细胞增殖率 将备用的细胞悬液接种于96孔板，90μl/孔，每组设4个复孔。4h细胞完全贴壁后加入受试药物，10μl/孔（倍比稀释AngⅡ，使其终浓度为1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L、0.125μmol/L、0.0625μmol/L和0.03125μmol/L）。置于培养箱中分别培养4h、12h和24h，之后每孔加入MTT液（5mg/ml）10μl，4h后分别在每孔加入三联液［10%十二烷基硫酸钠-5%异丁醇-0.012mol/L盐酸（w/v/v）］100μl/孔，置于培养箱中12h后，用EL340酶联免疫仪在570nm单波长下测定每孔的OD值。细胞增殖率（%）=（实验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值×100%

    1.2.4 ECV304细胞光镜形态学观察 分别用含有AngⅡ（浓度分别为0.0625、1μmol/L）、NAC（1μmol/L AngⅡ+10mmol/L NAC）的培养基和完全培养基培养，12h后置倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

    1.2.5 ECV304细胞内·OH含量测定 将上述所得的细胞悬液与不同浓度的AngⅡ分别共同培养12h和24h，应用检测试剂盒，按试剂盒说明书进行操作。

    1.2.6 统计学处理 应用SPSS12.0软件包进行分析，分别对各个实验组进行单因素方差分析，当P<0.05时，进一步作任一两均数的比较用q检验;对不同时间（12h和24h）的ROS（·OH）含量相比进行配对t检验;对ROS（·OH）的含量与ECV304细胞增殖率的关系进行相关分析，结果用均数±标准差（ˉx±s）表示，以P<0.05判定为差异有显著性。

    2 结果

    2.1 AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的影响 不同浓度的AngⅡ作用ECV304细胞4h时，细胞增殖不明显，与正常对照组相比差异无显著性（P>0.05）;作用时间为12h时，不同浓度AngⅡ（0.03125～1μmol/L）均可促细胞增殖，与正常对照组相比差异有显著性（P<0.05），0.0625μmol/L AngⅡ促细胞增殖率达到最大，随AngⅡ浓度的增大，细胞增殖率反而逐渐减小;作用时间为24h时，细胞呈负增殖，随AngⅡ浓度的增大，增殖率逐渐降低。AngⅡ作用细胞12h时，与相同浓度组作用时间4h相比，细胞增殖率差异有显著性（P<0.05），见表1。

    表1 AngⅡ在不同时间对ECV304细胞增殖作用的影响 （略）注:与正常对照组相比， ▲ P<0.05;与4h相同浓度组相比，* P<0.05 

    2.2 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞增殖的抑制作用 与AngⅡ处理组相比细胞增殖率差异有显著性（P<0.01），10mmol/LNAC可抑制1μmol/L AngⅡ对ECV304细胞的增殖作用，而与正常对照组相比差异无显著性（P>0.05），见表2。

    表2 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞增殖的抑制作用 （略）注:AngⅡ处理组:AngⅡ浓度为1μmol/L;NAC干预组:1μmol/L AngⅡ+10mmol/L NAC与AngⅡ处理组相比， ** P<0.01

    2.3 AngⅡ对ECV304细胞形态学变化的影响 正常对照组培养的ECV304细胞，4h后大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角，球形，少数细胞伸展，12h时，细胞逐渐生长呈梭形，有些细胞鱼贯状相连。0.0625μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12h后，可诱导细胞增殖，核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂象多见，胞浆丰富，内含小颗粒，细胞呈单层铺路石状排列。1μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12h后，核分裂象减少，部分细胞变圆，贴壁力减弱甚至消失。NAC干预组培养的ECV304细胞，核分裂象不明显，细胞生长与正常对照组相当。

    2.4 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞·OH含量的抑制作用 不同浓度的AngⅡ作用于ECV304细胞12h时，AngⅡ作用ECV304细胞产生·OH的含量与AngⅡ呈剂量和时间依赖性，随着浓度的增大和时间的延长，ECV304细胞的·OH含量逐渐增加，与正常对照组相比差异有显著性（P<0.05）。相同浓度AngⅡ作用12h与24h时·OH含量相比，差异有显著性（P<0.05）。NAC干预组与AngⅡ处理组的·OH含量相比，差异有显著性（P<0.05），而与正常对照组相比差异无显著性（P>0.05），见表3、4。

    表3 AngⅡ对ECV304细胞·OH含量的影响 （略）注:与正常对照组相比， ▲ P<0.05;与24h相同浓度组相比， * P<0.05

    表4 NAC对AngⅡ诱导ECV304细胞·OH含量的抑制作用 （略）注:AngⅡ处理组:AngⅡ浓度为1μmol/L;NAC干预组:1μmol/L AngⅡ+10mmol/L NAC与AngⅡ处理组相比， △ P<0.05

    2.5 ECV304细胞的·OH含量与细胞增殖率关系的评价 不同浓度AngⅡ（0.0625～1μmol/L）作用于ECV304细胞12h时，·OH的含量与细胞增殖率呈显著负相关（r=-0.800，P=0.000<0.01），见图1。

    图1 ECV304细胞·OH含量与细胞增殖率的相关性

    3 讨论

    血管内皮细胞发生氧化应激反应，在其特定的组织位点上氧化作用和抗氧化作用的平衡失调，蓄积产生ROS;AngⅡ被认为是血管氧化应激的主要诱导剂，可通过NADPH氧化还原酶诱导血管内皮细胞产生O 2- ，经自由基链反应，产生·OH ［6，7］ 。新近文献报道氧化应激产生的ROS在一定量时，可作为血管内皮信号转导分子，参与调节细胞功能 ［5］ 。研究表明，AngⅡ可诱导血管平滑肌细胞产生内源性ROS引起细胞增殖，在心血管疾病的发生发展中具有重要作用 ［8］ 。但AngⅡ是否通过一定的氧化还原敏感信号转导途径促进血管内皮细胞增殖，以前的研究尚未证实。本实验结果发现:不同浓度的AngⅡ用ECV304细胞4h时，细胞增殖不明显;作用时间为12h时，不同浓度AngⅡ（0.03125～1μmol/L）均可促细胞增殖，0.0625μmol/L AngⅡ促细胞增殖率达到最大，随AngⅡ浓度的增大，细胞增殖率 反而逐渐减小;作用时间为24h时，细胞呈负增殖。在AngⅡ诱导血管内皮细胞增殖过程中，伴随有ROS（·OH）含量的变化，并且与内皮细胞的增殖率呈显著负相关。结果表明，AngⅡ是ECV304细胞氧化应激产生ROS（·OH）的诱导剂，可诱导ECV304细胞产生ROS（·OH），ROS（·OH）含量与AngⅡ呈时间和剂量依赖性，一定量的ROS（·OH）有促进细胞增殖作用，随着ROS（·OH）含量的增多，细胞呈负增殖，提示ROS（·OH）在调控细胞增殖中起重要作用。NAC常被用于研究自由基在体内外的生物化学作用。NAC对细胞具有抗氧化保护作用 ［9，10］ 。本研究结果发现，抗氧化剂NAC明显减少AngⅡ诱导的ECV304细胞产生的ROS（·OH）含量，并且明显抑制AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖。这提示ROS（·OH）可能是AngⅡ诱导的ECV304细胞增殖的主要信号转导分子之一。

    参考文献

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    （编辑清 泉）

    基金项目:云南省自然科学基金项目（2001C0047M），云南省重点学科建设项目基金
    作者单位:650031昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室（△ 通讯作者）