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【摘要】 目的 探讨P 53 基因突变与食管癌淋巴结转移的关系。 方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）结合银染技术，对48例食管癌患者组织中P 53 基因第5～8外显子进行了突变分析。 结果 48例食管癌标本中，P 53 基因第5～8外显子出现突变者21例，其突变率为43.75%。其中23例伴有淋巴结转移的原发癌中14例出现了突变（60.86%），其与无淋巴结转移组（28.0%，7/25）相比差异有显著性（P<0.05）。 结论 P 53 基因突变与食管癌的转移可能有密切关系。
【关键词】 食管癌 P 53 基因 突变 转移 聚合酶链反应-单链构象多态性
Clinical study on the relationship between P 53 gene mutation and lymph node metastasis of esophageal carcinoma
Gao Yuanxing，Dong Shuai，Dong Guangtong，et al.
The Department of Anesthesiology，First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang325000.
【Abstract】 Objective To discuss the relationship between P 53 gene mutation and lymph node metastasis of esophageal carcinoma.Methods In48esophageal carcinoma tissues，the exon5～8mutation in P 53 gene is analyzed by polymerase chain reaction-single strand conformaton polymorphism（PCR-SSCP）combined with silver staining technique.Results In48esophageal carcinoma samples，the exon5～8mutation of in P 53 gene is detected in21cas-es，and the mutation rate is43.75%.In23primary carcinomas accompanied with lymph node metastasis，the mutation is detected in14cases and the mutation rate is60.86%，which compared with the group of none lymph node metasta-sis（28.0%，7/25），the difference is significant（P<0.05）.Conclusion The possibility of close relationship exists between P 53 gene mutation and lymph node metastasis of esophageal carcinoma.
【Key words】 esophageal carcinoma P 53 gene mutation metastasis polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism
近几年来有许多学者在研究食管癌的发生与许多肿瘤相关基因的异常有关，其中P 53 基因的突变较为常见 ［1，2］ 。检测P 53 基因的改变对了解肿瘤的发生、发展具有生物学意义。本研究应用银染PCR-SSCP方法检测本院食管癌组织中P 53 基因突变，探讨P 53 基因突变与食管癌淋巴结转移的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2002年1月～2004年12月本院48例食管癌施行了手术，男33例，女15例，男性平均年龄50.8岁，女性平均年龄53.9岁。48例标本中，伴淋巴结转移者23例，无淋巴结转移者25例。患者术前均未接受放疗和化疗，病理检查证实为鳞癌。所有组织标本均经福尔马林固定，石蜡包埋。首先对照光镜下形态，用刀片最大程度去除癌组织中正常组织成分。切片5张（μm），置Eppendorff管中，提取DNA。正常组织为食管切除标本的切缘。
1.2 聚合酶链反应（PCR） 根据已知的P 53 基因序列设计PCR引物，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。分别扩增P 53 基因第5、6、7、8外显子（见表1）。PCR扩增条件为50μl反应体系中包括基因组DNA200ng两种引物各 25pmol/L，dNTP各10mmol/L，TrisCl（pH8.3）10mmol/L，KCl50mmol/L，MgCl 2 22mmol/L，0.01%明胶，0.05%甲酰胺和TaqDNA聚合酶0.3μl（1.5U）。反应液上覆盖灭菌矿物油。扩增条件为93℃，30s;57℃，60s;72℃，30s。35个循环后，72℃延伸5min。
表1 PCR扩增所用引物外显子（略）
1.3 SSCP银染 取12μl PCR产物变性后，加入8μl变性缓冲液混匀，在非变性聚丙烯酰胺凝胶上用10mA恒电流电泳6h，银染颜色分析，照像并记录结果。根据SSCP凝胶上出现异常移动的电泳条带，判断阳性结果。即阳性标本与正常对照比较，其单链DNA都出现条带数量的增加、减少或位置的相对移动。
1.4 统计学处理 采用χ 2 检验。
2 结果
PCR-SSCP分析48例食管癌及相应正常组织经PCR-SSCP银染后，P 53 基因第5～8外显子出现突变者21例，阳性率为43.75%，其中23例伴有淋巴结转移的原发癌中14例出现了突变，阳性率为60.87%（14/23），25例无淋巴结转移的食管癌中7例出现了突变，阳性率为28.0%（7/25）。两组结果相比，差异有显著性（P<0.05），见表2。异常电泳条带在5～8外显子中的例次数分别为10、2、4、6次。
表2 有、无淋巴结转移组P 53 基因突变的比较 （略）注:χ 2 =5.259，P<0.05
3 讨论
目前已在食管组织的癌前病变中检测到P 53 基因的突变和突变型P 53 蛋白的聚集。在P 53 基因改变中，点突变是最常见的基因改变，突变位点大多集中于P 53 的序列特异性DNA结合区，即高度保守的第Ⅱ～Ⅴ功能区，相应于P 53 的5～8外显子 ［1］ 。用PCR扩增DNA序列的高度特异区，行SSCP检测，不同的等位基因可形成不同的电泳条带。PCR-SSCP检测目前已知的突变是可靠而便捷的方法，并逐渐成为最广泛应用的基因筛查技术 ［2］ 。本文应用PCR-SSCP方法着重研究食管癌组织中P 53 基因的5和8外显子，发现P 53 基因突变主要发生在P 53 基因的第5和8外显子，与以往DNA序列分析结果相似。对食管癌组织中P 53 基因的5、6、7、8四个外显子的PCR-SSCP分析，确定突变频率。我们在43.75%的食管癌组织中检出P 53 基因突变，其中伴有淋巴结转移的原发癌的P 53 基因突变串为60.87%（14/23），无淋巴结转移的食管癌的P 53 基因突变率为28.0%（7/25）。统计分析表明，食管癌的P 53 基因突变与有无淋巴结转移可能密切相关（P<0.05）。P 53 基因是一种抑癌基因，野生型的P 53 基因在细胞的增殖调控中起重要作用，参与G 1 期细胞的调控基因的扩增。研究表明，在人类恶性肿瘤发展过程中出现P 53 基因的突变，该突变导致氨基酸的取代，出现蛋白质结构的变化，Benett等 ［3］ 研究发现，食管癌变过程中，P 53 基因突变和蛋白产物的聚积先于肿瘤的浸润，是癌变过程中的早期事件。但是P 53 蛋白产物的聚积在癌变后得不到保留，其意义尚待进一步的研究。
参考文献
1 Cho Y，Gorina s，Jeffery PD，et al.Crystal structure of P53tumor sup-pressor-DNA complex:understanding tumorigenic mutations.Science，1994，265（5170）:346-355.
2 Spinardi L，Mazars R，Theillet C.Protocols for an improved detection of point mutations by SSCP.Nucleic Acids Res，1991，19（14）:4009.
3 Bennett W P，Hollstein MC，Metcalf RA，et al.P53mutation and protein accumulation during multistage human esophageal carcinogenesis.CancerRes，1992，52（21）:6092-6097.
（编辑日 强）
作者单位:325000温州医学院附属第一医院
310006浙江大学医学院
325027温州医学院