脑康灵口服液对偏头痛大鼠神经细胞凋亡的影响

　　【摘要】 目的  研究脑康灵口服液对偏头痛大鼠神经细胞凋亡的影响。 方法  采用硝酸甘油偏头痛模型大鼠，运用透射电镜和流式细胞仪技术进行研究。 结果  脑康灵口服液可改善硝酸甘油型偏头痛大鼠神经细胞超微结构异常，降低总体细胞凋亡发生率和神经细胞凋亡百分率。 结论  说明脑康灵口服液对硝酸甘油型偏头痛大鼠神经细胞凋亡具有抑制作用。

　　【关键词】  脑康灵口服液;偏头痛;细胞凋亡;大鼠

     Effect of Naokang ling oral liquid on nerve cell injury of migraine rat

　　LI Xin-tian，QIU Cai-rong，LINYu，et al.

　　The3rd Hospital of PLA，Baoji721004，China

　　【Abstract】 Objective To study the effects of Naokang ling oral liquid on nerve cell apoptosis of migraine model rat.Methods To choose disease model of migrane withnitroglycerin by means of flow cytometry and transmission electron microscope.Results Naokang ling oral liquid can adjust the abnormal ultramicro-structure of nerve cell of migraine model rats，decrease the incidence and the apoptosis percentage.Conclusion Naokang ling oral liquid can block the nerve cell apoptpsis of migraine model rat.

　　【Key words】 naokang ling oral liquid;migraine;apoptosis;rat

     脑康灵口服液是由天麻、当归、川芎、丹参、地龙、钩藤等组成，临床用于治疗颅脑外伤引起的头痛、头晕、恶心、呕吐等。目前，国内外学者对偏头痛发病机制分别从血管、神经、免疫、基因表达及微量元素等方面进行了研究，取得了可喜的成果，但有些问题还需要进一步探讨。为此，本文采用透射电镜和流式细胞仪技术在脑康灵口服液（naokang ling oral liquid，NKL）对硝酸甘油型偏头痛大鼠神经细胞形态学、凋亡情况、凋亡率及凋亡峰等方面的影响进行了研究。

　　1 材料

    1.1 药物 NKL口服液，由本院药剂科提供。麦角胺咖啡因片（cafergot，CFG），每片含酒石酸麦角胺1mg（由上海信谊药业有限公司生产，生产批号:000401）。硝酸甘油注射液（nitroglycerininjection，NTG）每1ml含硝酸甘油5mg（由广州明兴制药厂生产，生产批号:000505）。实验时用注射用水配制成所需浓度。

    1.2 试剂 碘化丙啶（PI），Sigma公司;RNAse A，QIAGEM公司;TritoX-100，E.MERCK公司;其余试剂均为市售分析纯。

    1.3 仪器 LKBⅢ型超薄切片机（瑞典）;日立H-600型透射电镜（日本）;COULTERESP型流式细胞仪（美国）。

    1.4 动物 SD大鼠，体重250～280g，由西安医科大学实验动物中心提供（医动字第8-005号）。

　　2 方法

    2.1 样品制备 取健康SD大鼠48只，雌雄各半。随机分为6组，即正常组、模型组、CFG组、NKL3个剂量组，每组8只。参照Cristina、Tassorelli等 ［1，2］ 报道的方法，复制硝酸甘油型SD大鼠偏头痛动物模型。除正常组外，其余各组动物sc硝酸甘油注射液10mg/kg。造模30min后按每组ig给药。正常组不作处理，模型组ig注射用水10ml/kg，CFG组ig CFG药液10ml/kg，NKL3个剂量组分别ig相应浓度的NKL药液10ml/kg。造模4h每只大鼠ip40mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉。尽量放血，断头，剪开颅骨，取出脑组织，除去脑膜和血管。每只大鼠均取同一部位的脑组织块（大脑皮层部位），备用。

    2.2 凋亡细胞形态学观察 ［3］  取健康SD大鼠36只，雌雄各半，随机分为6组，每组6只。样品制备方法同2.1。将取材的新鲜脑组织块，加入3%戊二醛中，固定30min，用0.1mmol/L PBS漂洗，1%锇酸溶液固定30min，梯度丙酮脱水，环氧树脂Epon812渗透包埋，70℃过夜聚合;LKBⅢ型超薄切片机切片，切片厚度为60nm;醋酸双氧铀—枸橼酸铅双重染色;日立H-600型透射电镜观察摄影。观察区域有暗细胞（系凋亡前细胞）、凋亡细胞和凋亡小体者，均属于大脑皮层神经元发生凋亡。记录神经细胞发生凋亡的动物例数，并对各实验组动物神经细胞凋亡发生率进行统计分析。质反应资料采用χ 2 检验分析，其中，χ 2 >6.635时，P<0.01;χ 2 >3.841时，P<0.05;χ 2 <3.841时，P>0.05。实验结果由正常组与模型组比较、给药组与模型组比较中得出。

　　2.3 凋亡细胞计数 ［4］  取健康SD大鼠48只，雌雄各半，随机分为6组，每组8只。样品制备方法同2.1项。将取材的新鲜脑组织块用PBS液漂洗，用剪刀剪碎成1mm 3 大小的碎块，加入适量0.5%TritonX-100裂解组织后，收集细胞悬液，1000r/min离心10min弃上清液。细胞用0.1mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗2次并悬浮之，加入终浓度为50mg/L的RNAseA，37℃恒浴1h，再加入PI染液至终浓度50mg/L。摇匀后4℃避光静置1h，经尼龙网过滤，调整细胞浓度为1×10 6 个/ml。在COULTER ESP型流式细胞仪上计数10000个细胞，氩离子激发光波长为488nm，测定各期细胞DNA含量、凋亡峰，并计算凋亡细胞百分率。

　    2.4 统计学处理 计量资料实验数据采用SPSS9.0统计软件对实验数据进行处理。实验结果由模型组和正常组进行比较，各给药组与模型组进行比较中得出。

　　3 结果

    3.1 动物行为变化 除正常组外，其余各组动物给予硝酸甘油30min左右，均出现双耳发红、前肢频繁搔头、烦躁不安等现象。模型组SD大鼠该现象持续约3h，继而出现蜷卧、活动减少等状态;给予NKL药液后，该现象逐渐消失，趋于正常。提示，硝酸甘油型偏头痛SD大鼠有头部不适表现，而NKL对其有逆转作用。

　　3.2 NKL对硝酸甘油型偏头痛SD大鼠神经细胞形态的影响 日立H-600型透射电镜下观察:正常组SD大鼠大脑皮层神经细胞形态正常;模型组SD大鼠大脑皮层神经细胞可见核固缩变小、核内异染色质增多、核膜皱缩不平、线粒体和粗面内质网均轻度肿胀等改变;给予NKL药液后，仅11.56g（相当于原生药）/kg剂量可使硝酸甘油型偏头痛SD大鼠大脑皮层神经细胞微观形态改变程度减轻，基本趋于正常，而5.82、3.62g（相当于原生药）/kg的NKL药液对硝酸甘油型偏头痛SD大鼠大脑皮层神经细胞微观形态改变无明显作用。从表1可以看出，给予硝酸甘油后，SD大鼠大脑皮层神经细胞可发生凋亡，模型组6例中有5例可见到凋亡细胞或凋亡小体，与正常组比较差异有显著性P<0.05）;NKL11.56g（相当于原生药）/kg剂量组SD大鼠未见凋亡细胞，神经细胞超微结构基本正常，与模型组比较P<0.01，而5.82～3.62g（相当于原生药）/kg2个剂量组SD大鼠有2～3例可见凋亡细胞，与模型组比较差异无显著性（P>0.05）。结果见表1表1 NKL对硝酸甘油型偏头痛SD大鼠神经细胞凋亡发生率的影响 （略）
   
    3.3 NKL对硝酸甘油型偏头痛SD大鼠神经细胞凋亡峰的影响 细胞发生凋亡时，会出现胞内DNA含量降低（因此时染色质DNA降解、断裂成小分子量的片断而从细胞内扩散出去）及在正常细胞G1峰前面出现一个DNA含量减少 的G1亚峰（Sub-G1Peak）的现象。我们的实验结果显示，正常组神经细胞绝大多数处于G1期，而模型组则表现为凋亡峰增高、细胞凋亡百分率明显上升，NKL能够逆转这一现象。

    3.4 NKL对硝酸甘油型偏头痛SD大鼠神经细胞凋亡的影响 从表2可看出，经硝酸甘油处理后，模型组神经细胞凋亡百分率明显升高，与正常组比较差异有非常显著性（P<0.01）。NKL11.56、5.82g（相当于原生药）/kg剂量组神经细胞凋亡百分率均有不同程度的降低，与模型组比较差异有非常显著性或差异有显著性（P<0.01～P<0.05）。而NKL3.62g（相当于原生药）/kg剂量组仅有改善的趋势，与模型组比较差异无显著性（P>0.05）。结果见表2表2 NKL对硝酸甘油型偏头痛SD大鼠神经细胞凋亡百分率的影响 （略）
    
    　4 讨论

    　细胞凋亡参与多种疾病的病理过程，在神经系统急性损伤如缺血、创伤、癫痫发作以及某些慢性神经性疾病引起的神经元缺失中，均有凋亡机制参与。目前，透射电镜观察法是观察凋亡细胞形态最好的方法。在流式细胞技术中，则以碘化丙啶（PI）为荧光染料测定细胞活力，灵敏度较高，因此，我们在实验研究中重点采用了这两种技术。

　　实验结果提示，NKL可改善硝酸甘油型偏头痛SD大鼠神经细胞超微结构异常，降低神经细胞凋亡的发生率和百分率。这说明NKL对硝酸甘油型偏头痛SD大鼠神经细胞凋亡具有较好的抑制作用。

　　【参考文献】

    　1 Crstina MS.Experimetal Headache Models，1996.

　　2 彭成，任永欣.实验性偏头痛模型c-fos、c-fun基因表达.中国实验动物学报，2000，8（2）:113.

    　3 陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社，1993，40.4 吴俊芳.神经生长因子对大脑皮质神经细胞凋亡的影响.中国药理学通报，1999，15（1）:45-47.

　　作者单位:721004陕西宝鸡，解放军第三医院

    （编辑:罗 彬）