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【摘要】 目的 建立一种简便、灵敏和快速分离测定鼠血清中腐胺、精脒和精胺等多胺含量的高效液相色谱-质谱联用方法。方法 采用苯甲酰氯衍生，选择性离子监测（SIM），方法的检测时间在10min以内。结果 腐胺、精脒、精胺定量检测限均达100pg/ml，日间和日内的测定精密度分别为2.4%～4.1%和1.9%～3.6%，回收率为90.8%～94.1%。结论 将该法用于胰腺癌裸鼠血清中多胺的测定，建立了一种胰腺癌药物筛选及其疗效评价的新方法。
【关键词】 多胺；LC/MS； 血清；苯甲酰氯
Simultaneous determination of putrescine， spermidine and spermine in the serum of mouse using LC/ESI/MS
CHENG Ji-ye，CHEN Min-jun，SHEN Ri-hua，et al.
School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200030， China
【Abstract】 Objective A simple， sensitive and fast method used for determining putrescine， spermidine and spermine in mouse serum using LC/ESI/MS has been proposed. Methods Benzoyl chloride was employed to derive polyamines to get better separation and detection limit. An ESI interface and the selected ion monitoring (SIM) mode were used. Results Satisfactory separation was achieved on an Agilent ODS-C18column by using the gradient elution with mobile phase consisting of methanol and water. The LC/ESI/MS analysis process took less than 10 minutes. The limits of quantification were all found up to 100 pg/ml for putrescine， spermidine and spermine. The intra-day and inter-day precision were in the range of 2.4% ～ 4.1% and 1.9% ～ 3.6% respectively. The recovery ranged between 90.8% and 94.1%. Conclusion Applied it to determine the polyamines in the serum of nude mice modeled as pancreatic cancer， the results indicated that the proposed method could be used for screening drugs of anti-pancreatic cancer and its therapy evaluation.
【Key words】 polyamines; LC/MS; serum;benzoyl chloride
多胺(腐胺putrescine，精脒spermidine，精胺spermine)是一类重要的内源活性物质，广泛存在于各种生物体内。通过参与DNA、RNA及蛋白质等生物大分子的物质代谢， 它在细胞的生长、发育、增殖过程中起重要作用。在快速繁殖的肿瘤细胞中，多胺的生物合成通常加快，含量增高［1～3］。有研究表明，在癌症病人接受治疗后，血液和尿样中的多胺浓度通常会降低，然而，当病人肿瘤复发或转移后，其多胺水平又会重新升高，提示多胺可作为临床上评价手术疗效以及肿瘤复发的生物标志物［4］。因此，快速准确测定各种生物样本如血样或尿样中多胺的含量具有重要的临床及生物学意义。
分离测试生物样品中的多胺方法主要有气相色谱法［5，6］，高效液相色谱法［7，8］以及毛细管电泳法［9，10］等。在这些方法中，高效液相色谱法应用最多，但往往需衍生，由于生物样本中大量的氨基酸等成分也会与衍生剂反应，干扰多胺的分离分析，使得其分离分析条件要求苛刻，分析过程耗时较长。气相色谱法和毛细管电泳法分析时间相对较短，但样品制备较为繁琐。高效液相色谱－质谱联用法具有灵敏度高、专属性强、分析速度快等优点，已广泛用于复杂生物样品的定性和定量分析。本文利用高效液相色谱-质谱联用方法，结合苯甲酰氯衍生化，提出一种简便、灵敏、快速的多胺检测方法，用于实验裸鼠血清中多胺含量的测定，获得满意的结果。
1 实验部分
1.1 试剂
腐胺、精脒、精胺对照品以及衍生化试剂苯甲酰氯均购自Sigma公司，色谱纯甲醇购于美国Meck公司，流动相水用Satoris纯水机配制，其余试剂为分析纯。
1.2 仪器
Agilent1100系列LC/MS液相色谱与质谱联用仪，包括两元梯度泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器及质谱检测器，Agilent ODS-C18色谱柱，5μm，250×4.6mm。
1.3 样品收集
取用原位移植性胰腺癌转移模型裸小鼠的血清。将裸小鼠分为ABCDE五组，每组各8只，均接种SW1990胰腺癌细胞，各组进行不同处理，其中A组为阴性对照组（生理盐水），B组为阳性对照组（化疗药物5-Fu 20mg/只），C、D和E组为自拟中药方胰腺2号小、中、大3个剂量的治疗组。
1.4 样品制备
将血清摇匀，准确吸取60μl血清至带塞试管，加入2mol/L KaOH 0.5ml，加入苯甲酰氯10μl混匀，37℃水浴并不断震荡反应20min，加入固体NaCl至饱和，加入乙醚2ml，震荡混匀，2500r/min离心5min，取出乙醚，用0.1mol/L KaOH洗涤乙醚3次，最后用氮气吹干，1ml甲醇定容。
1.5 色谱条件
流动相由水(A)和甲醇(B)两相组成，采用梯度洗脱，洗脱程序为0→15min，B由60%→100%，柱温40℃，检测波长254nm，流速1.0ml/min，进样20μl。
1.6 质谱检测条件
离子化方式：电喷雾离子化；离子极性：正离子；选择性离子检测：腐胺，m/z：319.1；精脒，m/z：480.2；精胺，m/z：641.3；电离电压：110v，毛细管电压：3700V；雾化气（氮气）流速为9L/min。
2 结果与讨论
2.1 苯甲酰氯衍生化
腐胺、精脒和精胺是一类极性强、呈碱性的小分子化合物，在常用的反相色谱柱上基本不保留，无法得以分离，经苯甲酰氯衍生后，因氨基与苯甲酰基相结合，不仅使得衍生化分子的极性减小，且碱性减弱，使得其色谱保留行为得以极大改善，3种多胺分子在常规ODS－C18色谱柱得到很好的分离，见图1（略）。
经苯甲酰氯衍生后，多胺的质谱检测灵敏度得以极大地提高。图2中为腐胺、精脒和精胺各100pg/ml混合物衍生前和衍生后经流动注射法-质谱(FIA-MS)的分析谱图。由图知，衍生前质谱响应强调值仅为1500，而衍生后质谱响应值达到80000以上，提示经衍生后多胺的检测灵敏度得以极大提高，增加幅度在50倍以上。
此外，由于腐胺、精脒和精胺的分子量均小于220，因血样等复杂的生物样品在荷质比(m/z)200以下存在大量的基质成分，换句话说，在该荷质比范围内即使采用选择离子监测（SIM）也很容易对多胺的检测色谱峰产生干扰。而经苯甲酰氯衍生后，腐胺，精脒，精胺的m/z分别达到319.1，480.2和641.3，此时样本基质干扰大为减少。因此，采用苯甲酰氯衍生化处理，可以改善多胺的色谱行为，提高质谱检测灵敏度以及减少生物样本基质的干扰。
2.2 多胺的质谱分析
图3中分别是腐胺、精脒和精胺经苯甲酰氯衍生化后的质谱图。苯甲酰氯衍生化过程是多胺中的氨基与苯甲酰基相结合，也就是说，经衍生化后每个氨基将接上一个苯甲酰基，分子量将增加104。以腐胺为例，其分子量为88.15，包含两个氨基，衍生化后的苯甲酰腐胺分子量为296.15，由此可推断图3(A)中m/z为319.1和615.2分别为苯甲酰腐胺与Na结合［M+Na］+和［2M+Na］+的分子离子峰。同理，由于精脒分子量为145.25，含三个氨基，图3（略）(B) 中m/z为480.2和937.3分别为苯甲酰精脒与Na结合［M+Na］+和［2M+Na］+的分子离子峰。精胺分子量202.3，含四个氨基，图3(B) 中m/z为641.3和1259.5分别为苯甲酰精胺与Na结合［M+Na］+和［2M+Na］+的分子离子峰。因此，本文以m/z为319.1、480.2以及641.3分别作为测定腐胺、精脒和精胺的选择监测离子。
2.3 质谱条件的优化
分别考察大气压化学电离离子化和电喷雾离子化两种离子化方式，结果发现离子极性为正离子的电喷雾模式离子化效果较好。以同一样品进样所得谱峰面积大小作为离子化效果评价的指标，进行质谱操作条件的优化。首先优化质谱电离电压，从 30V到150V每隔20V设置一个实验点，对同一样品进行检测，结果表明110V对3种选择离子而言总体离子化效果最佳，故选定110V为电离电压。其次，还对毛细管电压进行优化，从2500V到4000V，每隔300V设置一个实验点，对同一样品进行检测，结果3700V离子化效果最佳，故选定其作为分析条件的毛细管电压。图4（略）为优化后腐胺、精脒和精胺在电离电压110V，毛细管电压3700V，正离子，扫描模式下的总离子图。
2.4 方法学考察
质谱线性关系：配制腐胺、精脒、精胺混合标准品，按前述方法进行衍生化，逐步稀释后测定，腐胺回归方程Y=87076X+15278(r=0.9963) ，精脒回归方程Y=21717X-11344(r=0.9964)，精胺回归方程Y=87286X+8649（r=0.9962）（线性范围100pg/ml～500ng/ml）。回收率测定：采用加样回收率法，测得腐胺、精脒、精胺加样回收率分别为94.1%、92.1%和90.8%，日间精密度分别为2.4%、3.8%和4.1%，日内精密度分别为1.6%、1.9%和3.6%(n=6)。
应用本文所建立方法测定ABCDE 5组裸鼠血清中的多胺，结果见表1。由表1知，与模型组A相比，阳性对照组B裸鼠血清中腐胺(P＜0.05)、精脒(P<0.05)以及精胺（P<0.01）含量均显著下降，提示精脒和精胺可作为药物疗效的评价指标。中药小剂量组C中，精脒(P<0.05)含量显著下降，而腐胺和精胺(P>0.05)没有显著变化；中药中剂量组D中，精脒(P<0.05)和精胺（P<0.05）含量均显著下降，而腐胺没有显著变化(P>0.05)；中药大剂量组E中，腐胺(P<0.05)、精脒(P<0.01)以及精胺（P<0.05）含量均显著下降；由此表明，该中药大剂量时在裸鼠动物模型中表现出较好的疗效，且中药组呈现出明显量效关系。Table 1. The determination results of the polyamines in the serum of the mice modeled as pancreatic cancer（略）Each value is represented as the mean x±s，(n=8).**P<0.01;*P<0.05Fig.5 Plot of the concentration ratios of putrescine/ spermine and spermidine/ spermine of the five groups of mice.
Group A: control animals; Group B: animals treat with 5-Fu; Group C～D: animals treated with low， middle and high dose of TCM respectively
图5（略）为腐胺与精脒含量比与精脒与精胺的含量比为坐标轴，各组样本的分布图。由图知，阴性对照模型组(A)与其它组相比差异均有显著性，尤其是与阳性药物组(B)差异有显著性，提示这两个比值指标可作为药物治疗胰腺癌效果评价的生物标志物。图中，中药各组（C、D和E）均与阴性对照模型组(A)差异有显著性。以各组中心与A组中心点距离作为疗效的评价指标，由图5知C、D和E各组中心点距离与A组中心点的距离呈递增趋势，提示该药物呈现明显的量效关系。
4 结论
本文提出一种简便实用的荷瘤裸鼠血清多胺含量测定的方法，定量检测限达到100pg/ml，可满足大部分生物样品中多胺的含量检测要求。另外，还将该法与胰腺癌裸小鼠动物模型相结合，创建了一种胰腺癌药物筛选及其疗效评价的新方法。
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10 Legaz ME， Vicente C， Pedrosa MM. J Chromatogr A， 1998， 823， 511-521.
基金项目：上海交通大学校内青年教师启动基金资助项目
作者单位： 1 200030 上海，上海交通大学药学院(△通讯作者)
2 200032 上海，复旦大学附属肿瘤医院
3 200030 上海，上海交通大学分析测试中心
(编辑：罗 彬)