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【摘要】 目的 确定甲硝唑注射液的无菌检查方法。方法 按中国药典2005年版二部无菌检查法（附录XI H）中薄膜过滤法进行验证。结果 采用薄膜过滤法细菌以500ml/筒冲洗量、真菌以300ml/筒冲洗量检查，在规定条件下敏感菌可正常生长。结论 甲硝唑注射液的无菌检查可采用薄膜过滤法检查（500ml/筒冲洗量）。
【关键词】 甲硝唑；方法验证；冲洗量
甲硝唑除用于抗滴虫和抗阿米巴原虫外，近年来，广泛地应用于抗厌氧菌感染，对拟杆菌属；梭形杆菌属；梭状芽孢杆菌属，包括破伤风杆菌；部分真杆菌；消化球菌和消化链球菌等厌氧菌有较好的抗菌作用，而对需氧菌或兼性需氧菌则无抗菌作用。根据2005年新版药典的规定［1］，当建立药品的无菌检查时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适用于该药品的无菌检查。笔者针对甲硝唑注射液的抑菌特性采用适宜方法消除其抑菌活性，拟建了该品种的无菌检查方法。
1 仪器与材料
1.1 仪器 HTY-2000A型集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），全封闭无菌试验过滤培养器（北京牛牛基因有限公司，批号：20051212）。
1.2 材料
1.2.1 样品 甲硝唑注射液。规格：100ml，0.5g；批号：05120812；样品来源：北京军区总医院制剂中心。
1.2.2 培养基和稀释液 北京三药科技开发公司生产的硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和玫瑰红钠琼脂培养基等。
1.2.3 验证试验用菌种 金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕（第4代）、枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕（第4代）、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕（第3代）、生孢梭菌〔CMCC（B）64 941〕（第4代）、白色念珠菌〔CMCC（B）98 001〕（第4代）、黑曲霉〔CMCC（B）98 003〕（第3代）。
2 实验与结果
2.1 菌液制备
（1）取经30℃～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。
（2）取经30℃～35℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-7备用。
（3）取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，备用。
（4）取经23℃～28℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，备用。
2.2 实验用菌液检验
2.2.1 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌 取上述金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌10-5～10-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30℃～35℃培养48h，做活菌计数。
2.2.2 生孢梭菌 取上述生孢梭菌10-7稀释液1ml加至12ml硫乙醇酸盐液体培养基中，30℃～35℃培养18～24h，菌团应清晰可数。
2.2.3 白色念珠菌和黑曲霉 取上述白色念珠菌10-5稀释液及上述黑曲霉10-4孢子悬液各1ml，用45℃改良马丁琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23℃～28℃培养，逐日观察，做活菌计数。菌落计数结果见表1。
2.3 过滤与冲洗 取一次性两联过滤器，先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液少量润湿滤膜，直至液体顺利流出。按规定将样品液滤入滤器，样品液全部过滤完毕后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次每筒注入冲洗液100ml，充分振摇、荡洗筒壁，完全排空后再循环操作，冲洗总量每筒分别为300ml，500ml，800ml。
2.4 培养与观察 分别将硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁液体培养基各100ml滤入相应滤器，将少于100cfu的6种试验菌加入相应滤筒，同时作阳性和阴性对照。分别置规定温度培养5天，逐日记录生长状况，观察不同冲洗量对6株阳性代表菌的影响。结果见表2～7。
2.5 验证结果 见表1～7。表1 菌落计数结果表表2 人工污染金黄色葡萄球菌结果表 表3 人工污染枯草芽孢杆菌结果表表4 人工污染铜绿假单胞菌结果表表5 人工污染生孢梭菌结果表表6 人工污染白色念珠菌结果表
3 讨论
表1～7结果表明，甲硝唑注射液按规定取量，表7 人工污染黑曲霉结果表采用薄膜过滤法，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以300ml/筒的量冲洗，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌及黑曲霉无明显抑菌活性，均可使其正常生长，而对生孢梭菌的抑菌活性不能完全消除；用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以500ml/筒的量冲洗，可以消除甲硝唑注射液对生孢梭菌的抑菌作用，使其正常生长。由此得出甲硝唑注射液采用薄膜过滤法进行无菌检查时，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的冲洗量应为细菌500ml/筒，真菌300ml/筒，以生孢梭菌为阳性对照菌检查，但为方便检查，建议细菌、霉菌均可采用500ml/筒的量冲洗。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典，2005年版二部.北京：化学工业出版社，2005，附录89-93.
作者单位： 100071 北京，北京军区联勤部药品仪器检验所
（编辑：若 木）