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【摘要】 目的 建立盐酸坦洛新缓释片微生物限度检查方法［1］，并对该法的有效性进行评价。方法 采用2种乳化方法，制备适宜微生物检测的供试液。以对照菌回收为主要内容，用样本组和对照组之间的回收率对有效性进行评价。结果 供试液制备方法中第2种方法制得均匀细腻的混悬液，所采用的乳化剂、稀释剂不干扰微生物的检出，方法验证结果符合《中国药典》［1］规定。结论 通过上述试验确定了盐酸坦洛新缓释片微生物限度检查方法。
【关键词】 微生物限度检查法;有效性;验证
Experimental study on microbial limit tests and validations of tamsulosion hydrochloride sustained release tables
XANG Dong,LI Ye,FAN Bing.Yunnan Institute for Food and Drug Control, Kunming 650011,China
【Abstract】 Objective To establish and validate to the method for the microbial limit tests of tamsulosion hydrochloride sustained release tablets.Methods Used for two kind of emulsified methods preparation testing liquid. The validation have been tested by microbial recovery and the availability was estimated by the ratio of recovery from the test group to the control group.Results Testing liquid emulsified by the second method is fine-even. The emulsifier and the diluent did not influence the tests. The result of validation conforms to the Chinese pharmacopoeia tallies.Conclusion The method for the microbial limit tests of tamsulosion hydrochloride sustained release tablets was established.
【Key words】 microbial limit tests; availability; validation
盐酸坦洛新缓释片中所含大量的羟乙基甲基纤维素为亲水性高分子材料，这些材料的特点是遇水后经水合作用而膨胀，形成稠厚的凝胶。按我国《药典》［1］规定的微生物限度检查常规法加入氯化钠-蛋白胨缓冲液后膨胀，成团，粘性大，不能形成均匀分散的供试液，无法进行检验，需采用合适的方法使药物溶解乳化，均匀分散于稀释剂中，便于检查。本实验分别选用十四烷酸异丙酯和吐温-80作为该缓释片的乳化剂，以得到符合要求的供试液，并对所选用的方法进行微生物限度检查方法学验证。
1 仪器与材料
1.1 仪器 XJA电动匀浆仪(浙江省台州市椒江五星机械仪器有限公司产品)。
1.2 培养基及试剂 营养肉汤培养基;改良马丁培养基；玫瑰红钠琼脂培养基;营养琼脂培养基;吐温-80;十四烷酸异丙酯;氯化钠-蛋白胨水；胆盐乳糖培养基;伊红镁蓝琼脂培养基;4-甲基伞形酮葡糖苷酸酸；液体石蜡(中国药品生物制品检定所)。阳性对照菌：大肠埃希菌［CMCC(B)44102］，金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］，白色念珠菌［CMCC(F)98001］(中国药品微生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心)。
1.3 供试品 盐酸坦洛新缓释片(本所检验样品)。
2 方法与结果
2.1 供试液制备方法
2.1.1 取供试品5ｇ，用乳钵研细，备用。另取吐温-80 10ml，液体石蜡30ml和无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液60ml，用匀浆仪4000r/min，搅拌2min，加入上述供试品，再用匀浆仪3000r/min，搅拌2min，即得1∶20均匀混悬液。
2.1.2 取供试品5ｇ，用乳钵研细，备用。另取十四烷酸异丙酯10ml、液体石蜡30ml、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液60ml，用匀浆仪4000r/min搅拌2min，加入上述供试品，再用匀浆仪3000r/min，搅拌2min，即得1∶20均匀混悬液。
方法“2.1.1”虽能制成较均匀的混悬液，但仍有小块团状物存在，且泡沫过多，粘度较大，不利于菌数的测定。方法“2.1.2”制成的混悬液均匀细腻，且泡沫少，粘度较小，便于吸取。本实验选用后者制备供试液。
2.2 阳性对照菌液的制备 取(a)大肠埃希菌、(b)金黄色葡萄球菌、(c)枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物接种于营养肉汤培养基中，37℃下培养18h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌数约为50～100 cfu的阳性对照菌液备用；另取(d)白色念珠菌的真菌琼脂斜面培养物接种于真菌培养基中，25℃下培养24h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含菌数约为50～100 cfu的阳性对照菌备用。
2.3 检查方法验证
2.3.1 细菌、霉菌及酵母菌菌数测定方法的验证（阳性菌回收率试验） 菌数测定所用培养基，培养温度，培养时间：加入(a)、(b)、(c)及相应空白组倾注营养琼脂培养基，30℃～35℃培养48h；加入(d)及相应空白组倾注玫瑰红钠琼脂培养基20℃～25℃培养72h。
2.3.1.1 阳性对照菌液组 取“2.2”项下对照菌液(a)、(b)、(c)、(d)各1ml，分别注入平皿，倾注相应培养基培养后，计数。结果见表1 表1 4种阳性菌回收率试验结果注：回收率(%)=对照组平均菌落数(cfu)-空白组平均菌落数(cfu) 阳性对照菌液组平均菌落数(cfu)×100
2.3.1.2 稀释剂组 空白组：十四烷酸异丙酯10ml、液体石蜡30ml、蛋白胨磷酸盐缓冲液60ｍl，用匀浆仪4000r/min搅拌2min，制成均匀细腻的乳浊液。取该乳浊液各1ml，分别注入平皿，倾注相应培养基培养。对照组：取该乳浊液各1ml分别注入平皿再分别加入“2.2”项下对照菌液(a)、(b)、(c)、(d)各1ml，倾注相应培养基培养后，计数。结果见表1。
2.3.1.3 供试品组 空白组：取“2.1.2”制备的供试液各1ml，分别注入平皿，倾注培养基培养后计数。对照组：取“2.1.2”制备的供试液各1ml，分别注入平皿，再分别加入“2.2”项下对照菌液(a)、(b)、(c)、(d)各1ml，倾注相应培养基培养后，计数。结果见表1。
以上各组每次试验用2个平皿，试验重复3次。
2.3.2 控制菌检查方法的验证（大肠埃希菌检查方法的验证） 取3瓶100ml胆盐乳糖增菌培养基，分别加入按“2.1.2”制备的供试液各10ml，其中一瓶加入“2.2”项下对照菌液(a)1ml(阳性对照组)， 一瓶加入对照菌液(b)1ml(阴性对照组)，培养后取该培养物0.2ml做MUG及靛基质试验。试验重复3次。结果见表2。表2 大肠埃希菌检查方法验证结果注：表中“＋”代表该反应呈阳性，“－”代表该反应呈阴性
3 讨论
3.1 供试液制备方法的选择。制备供试液时，力求均匀分散。因为微生物限度检查中测定结果与匀质方式及条件极为有关。盐酸坦洛新缓释片中的羟乙基甲基纤维素遇水后膨胀，形成稠厚的凝胶，但易溶于液体石蜡。十四烷酸异丙酯为无色无味液体，具有较好的增溶和乳化作用，与液体石蜡等油相可以任何比例混合。我们采用“2.1.2”方法制成的供试液均匀细腻，经放置观察不分层，质量稳定。
3.2 《中国药典》［1］规定细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证的回收率应不低于70%，低于70%则表明样品有抑菌作用。控制菌检查方法验证时，阳性对照菌应检出，阴性对照菌不得检出［2］。如验证结果达不到规定，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并对方法重新进行验证。从以上结果可以看出，试验方法达到规定要求。
3.3 《中国药典》［1］规定若供试液的制备经乳化等特殊处理，应在方法验证时增加稀释剂组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度，从本文试验结果可以看出，微生物未受影响。
【参考文献】
1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典，2005年版. 北京：化工工业出版社，2005，二部附录：93.
2 马绪荣，苏德模. 药品微生物学检验手册.北京：科学出版社，2000，256.
作者单位： 1 650011 云南昆明，云南省食品药品检验所
2 710001 陕西西安，陕西省中医药研究院
(编辑：罗 彬)