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【摘要】 目的 研究大鼠动脉导管平滑肌中的三磷酸腺苷（ATP）敏感的钾离子通道（KATP）及电压依赖的钾通道（Kv）的发育变化及其在动脉导管收缩中的作用。方法 通过测量胎龄19天（早产）及21天（足月）（n=8）胎鼠动脉导管血管环张力及利用全细胞膜片钳技术方法测量动脉导管单个平滑肌细胞的钾离子电流，观察KATP激动剂吡拉地尔和KATP阻断剂格列本脲，Kv阻断剂4-氨基吡啶对动脉导管收缩和钾离子电流的影响。结果 格列本脲可收缩胎龄21天胎鼠的动脉导管，但对19天的无作用。钾电流可以因吡拉地尔增加，因格列本脲减少，但这种减少的电流在胎龄21天的动脉导管要明显大于19天的。4-氨基吡啶在两组作用无明显差异。结论 本研究数据提示在早产儿与足月儿比较，总的Kv电流无明显差异，但KATP电流明显减少，KATP通道未发育成熟，支持KATP在动脉导管平滑肌作为一个氧感受器，是早产儿动脉导管未闭发生率高的原因之一。
【关键词】 动脉导管；氧气；钾离子通道；早产儿
The role of potassium channels in oxygen-induced contraction of ductus arteriosus in fetal rat of different gestation age
SHEN Jing， Toshio Nakanishi.
Department of Pediatrics， Peking Union Medical College Hospital， Beijing 100730， China
【Abstract】 Objective To investigated the role of ATP sensitive potassium channel and voltage-dependent potassium channel in oxygen-induced contraction of ductus arterioses of rat. Methods Isometric force of contact tissue and potassium current in single smooth muscle cells of ductus arteriosus were measured in two groups of rats of 19th （premature） and 21st （mature） gestation age respectively. The effects of pinacidil（KATP activater）， glybenclamide （KATP inhibitor）， and 4-aminopyridine（KV inhibitor） were investigated.Results glybenclamide contracted ductus arteries in 21st group but not in 19th group. Potassium current increased by applying pinacidil in the perfusion solution and decreased by glybenclamide.The change of the currents， together with the depolarization of the membrane potential were significant greater in 21st group then in 19th group. No significant different effect of 4-aminopyridine was observed between two groups.Conclusion KATP but not KV channel may be one of the O2 sensors in ductus arterioses. It was underdeveloped in premature fetus. and participate in their poor reaction to oxygen and high incidence of patent ductus arteriosus.
【Key words】 ductus arteriosus； oxygen； potassium channel； premature fetus
新生儿的动脉导管通常在生后数小时到数日关闭。出生后随着呼吸的开始，血氧分压升高是动脉导管收缩的重要原因。早产儿动脉导管对氧浓度变化的反应欠佳，与早产儿动脉导管对氧的敏感性尚未成熟有关。提高灌流液氧分压可引起离体动脉导管收缩。这种氧气引发的动脉导管收缩的机制尚不明确。氧气诱导血管内皮释放内皮素是使动脉导管收缩的原因之一［1］。Roulet和Coburn［2］发现血氧分压升高可引起细胞膜去极化。研究发现ATP依赖的钾通道（ATP-dependent K channel，KATP，）阻断剂格列本脲，可收缩动脉导管；而KATP开放剂克罗卡林，可以拮抗氧气引发的动脉导管收缩［3］。因此，笔者推测富氧可以关闭KATP，从而使平滑肌细胞膜去极化。但是Tristani-Firouzi等［4］发现在动脉导管也存在着电压依赖的钾通道（voltage-dependent K channel，Kv），并在富氧的条件下关闭，因此他们认为动脉导管上的氧感受器是Kv。KATP和Kv在动脉导管收缩中的作用仍然没有定论。在我们以前的实验中发现，氧气引发的动脉导管收缩现象只在胎龄21天的胎鼠动脉导管出现，而在19天的不能引出［5］。在动脉导管中作为氧感受器的通道，在早产儿应该尚未发育成熟。因此，本研究的目的是了解胎鼠动脉导管平滑肌中KATP和Kv发育情况及它们在动脉导管收缩中的作用，以探明动脉导管的收缩机制。
1 对象与方法
1.1 对象 未生育过的Wister鼠，过夜交配后若在阴道拭子发现有精子则初步判断受孕并定为胎龄第0天（足月21.5天）。胎龄19或21天时用苯巴比妥（50 mg/kg）腹腔麻醉母鼠后剖腹取胎鼠。整个过程遵循美国生理协会的相应规则。所有试剂及药品均来自美国Sigma公司。
1.1.1 测量张力使用完整动脉导管环 分离出胎鼠的纵隔组织并置于HEPES缓冲液中。HEPES液成分（mM）：NaCl， 142； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； HEPES， 5； 用NaOH 滴定到pH 7.4，再用100%氮气（N2）平衡。在解剖显微镜下从胸腔取出动脉导管，制备成0.4～0.6mm长的血管环段，然后放于37℃的浴槽。
1.1.2 电生理实验使用新鲜分离的单个平滑肌细胞 所有用于制备和保存单个动脉导管平滑肌细胞的液体均以100%N2平衡。动脉导管和肺动脉从胸腔取出后放置于去钙的Hanks溶液。Hanks液成分（mM）：NaCl 138.8， KCl 5.4， NaH2PO4 1.2， MgCl2 0.5， HEPES 10， EGTA 0.1， 用1M NaOH滴定到pH 7.4。然后把血管剪成小片、置于没有EGTA的Hanks'消化液，其中含有木瓜蛋白酶0.4mg/ml， 二硫苏糖醇 0.19mg/ml， 以及牛血清白蛋白0.2mg/ml；在37℃水箱中消化5～8min，再置于没有EGTA、含有胶原酶0.25mg/ml的Hanks'液，37℃消化5～7min。再把胶冻样的组织用毛细吸管移至加有10 mg/ml葡萄糖的普通Hanks'液并保存在冰中，实验开始前轻轻搅动即可获得单个细胞。
1.2 方法
1.2.1 血管张力测量 按照常用的等容收缩方法测量血管张力。用两根直径25μm的钨丝穿过血管腔，通过压力传感器（Leonia公司Kulite半导体）接到肌动描记器，并记录等容收缩的张力。实验开始后，用Krebs-Henseleit（K-H）液以10 ml/min的速度灌洗。K-H液成分（mM）: NaCl， 118； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； NaHCO3， 24； NaH2PO4， 0.436，用95%N2＋5%CO2气体平衡，使浴槽中灌洗液pH值为7.38～7.42；氧分压22～25mmHg；二氧化碳分压35～42mmHg。在使用高钾溶液（钾浓度 50 mM）时，用等摩尔的KCl替代NaCl。
记录血管轴长，两条钨丝之间的距离及牵拉开始时的牵引力。以牵引力（mN）除以血管轴长（mm）表示血管壁张力（mN/mm）。对19和21天胎龄的标本，调节其基础张力分别到0.3～0.5mN/mm （平均0.4±0.1）和 0.6～0.8mN/mm （平均0.7±0.1）。
采用3种方法使动脉导管环收缩：4μM格列本脲（KATP 通道阻断剂）；10mM 4-氨基吡啶（4-AP）（Kv阻断剂）；以及50mM KCl。格列本脲和4-AP均溶解在K-H液中。
1.2.2 膜片钳实验 低氧液以6ml/min 的速度灌洗，组织池中的氧分压由血气机（Ciba Corning 280）测定，间隔5min采样，连续3次保持在30～35mmHg时开始实验。细胞放置于操作池中，选择纺锤状、表面光滑、折光性好的平滑肌细胞。电极内液成分（mM）：KCl 20， KOH 120， MgCl2 2， EGTA 10， HEPES 5， Mg-ATP 1或5， aspartate 60 （pH 7.4）。灌流液成分（mM）：NaCl 143， KCl 5.4， NaH2PO4 0.33， MgCl2 0.5， HEPES 5， NaOH调节pH到7.4。灌流液用100%氮气平衡。利用二甲亚砜溶解KATP激动剂吡拉地尔和KATP 通道阻断剂格列本脲，并使后二者在灌流液中的浓度分别为1～10μM和4μM。灌流液中二甲亚砜的浓度不超过0.2%。
电极后尖端阻抗为5～6MΩ。调整微推进器，完成GΩ封闭后，副压吸引形成全细胞结构。利用Axopatch 200B 放大器，由 pClamp8.2 发放刺激脉冲，采样频率为10kHz，低通滤波频率为2kHz，记录静息膜电位及电流。刺激方案为：保持电位在-70 mV使钾电流失活，从-80mV到+60 mV范围，阶跃10mV， 刺激频率0.1 Hz。电流密度表示为电流与细胞膜容积之比，单位pA/pF。被吡拉地尔激活并被格列本脲抑制的电流即是KATP 电流。
1.3 统计学方法 在Stateview及Clamfit分析软件下处理结果。取电流时程的最后400ms数据进行测量。结果用平均值±标准差表示。未配对的两组均值比较采用t检验。对药物反应的统计学比较采用配对t-检验和分析变量的重复测定。P<0.05提示有统计学意义。
2 结果
2.1 动脉导管张力 高钾（50mM）使细胞膜去极化，在两组（n=8）.均可使动脉导管收缩（P>0.05）；在两组均可观察到4-AP引起的血管收缩（P>0.05）；只在21天组可见由格列本脲引起的动脉导管收缩（P<0.05）。
2.2 动脉导管平滑肌细胞钾电流 在生理条件下不同血管平滑肌细胞内的ATP浓度约为1.5～4mM［6，7］。但是在低氧环境下动脉导管平滑肌细胞内的ATP浓度未见报道。 本实验中选择1mM和5mM二种浓度作为电极液来测量KATP 电流。当使用ATP浓度为5 mM的电极液时，两组均显示被格列本脲阻断的钾离子电流最小，提示在这时KATP 通道是关闭的。同时，笔者还观察了吡拉地尔和格列本脲的作用。即使在5 mM ATP 内液的情况下，吡拉地尔仍然可以有效地激活钾离子通道。因为在高浓度时（>100μM）吡拉地尔也会激活KCa通道［8］，故在用吡拉地尔之前常规加入1 mMTEAC 以减少误差。
在21天组，由10 μM 吡拉地尔激活的钾电流比19天组明显增多。在两组中均发现10 μM 吡拉地尔激活的钾电流最大，浓度继续升高并没有同期增多的电流。被格列本脲阻断的钾电流大小与被10 μM 吡拉地尔激活的钾电流大小相等。这种电流在21天组明显大于19天组。
当使用1 μM ATP 作为电极液时，4 μM 格列本脲可明显抑制钾电流， 提示在这种条件下KATP 是开放的。而且这种电流在21天组明显大于19天组（p <0.05）。吡拉地尔可激活钾通道，而且这些被激活的电流可以被格列本脲阻断，阻断的电流比激活的稍大，也表明在基础条件下，有部分KATP 是开放的。这种被阻断的钾离子电流在足月组也明显高于早产组。
两组的膜电位没有差别（足月组-40.7±3.3 mV，早产组-41.5±4.0 mV）。格列本脲可明显改变单个细胞膜电位，并且在两组间有明显差异（足月组33.3±3.3 mV，早产组8.2±2.8 mV，P<0.01）。
3 讨论
细胞内ATP浓度低时KATP 通道开放［9］，这时给予格列本脲可以使之关闭。如果有较多的KATP 通道被关闭，可以导致细胞膜的去极化，从而开放电压依赖的钙通道，增加细胞内钙浓度，使血管平滑肌收缩。有报道格列本脲可以收缩足月新生兔的动脉导管［3］。本实验中，格列本脲也可使足月大鼠的动脉导管发生明显收缩。这些数据提示在低氧环境，成熟胎鼠动脉导管KATP是开放并且有功能的。但在未成熟胎鼠却看不到这种格列本脲引起的动脉导管收缩现象，提示在未成熟胎儿动脉导管的KATP 是无功能或者是未发育完善的。在我们以前的实验中证实了氧气可以使胎龄21天的大鼠动脉导管收缩但对19天的无效；而且未成熟胎儿的血管收缩系统，包括平滑肌细胞膜的去极化、细胞内钙浓度的增加以及细胞内钙活化收缩蛋白等与成熟胎儿比较没有明显差别，但对血氧变化的感应机制不成熟［5］。这些结果支持KATP 是动脉导管的氧感受器之一。因为4-AP引起的收缩在两组无明显差别，提示在早产鼠动脉导管的总的Kv通道与成熟鼠没有区别。当然，因为Kv通道有很多亚类， 在未成熟胎儿的动脉导管也可能存在某些KV亚类发育不完善，尚不能完全排除KV 也是动脉导管的氧感受器之一。
KATP 通道的活性与细胞内三磷酸腺苷（ATP）， 二磷酸腺苷（ADP）和其他二磷酸核苷的浓度及比例有关［10］。在缺氧时血管平滑肌组织ATP浓度是否降低仍无定论。以前的实验显示，在动脉导管组织，当灌流液从低氧改到富氧状态后，由340nm 激发的自发荧光强度虽然降低得不多但具有统计学意义［3］。提示荧光底物（如吡啶核苷酸）浓度在低氧环境中因为无氧代谢而有所增加。Shigemori［11］提出低氧环境可以明显降低门静脉和肺动脉中的ATP浓度；但Leach等［6］在报告中指出， 在静息状态且没有受到牵拉的动脉，低氧并不会明显降低其组织ATP浓度。在生理状态下，血管平滑肌细胞内的ATP浓度为1.5 ～4mM［6，7］。在本研究中，笔者选择了两种ATP浓度作为吸液管内液：1mM和5mM。在吸液管内液ATP浓度为1mM时，格列本脲可以明显阻断钾电流，而在5mM组则未见此现象。这表明 KATP 通道在1 mM ATP这表明KATP 通道在1 mM ATP环境中是开放的，而在5 mM ATP 环境中是被抑制的。有报道当ATP浓度在10～200μM时，血管平滑肌细胞的KATP 电流可以有一半被阻断［10］。本研究也发现在动脉导管平滑肌细胞，较高浓度ATP可以阻断其KATP 电流。在缺氧状态时的ATP浓度改变，可以改变KATP通道的活性，从而使动脉导管扩张。但是不同部位血管组织的KATP 通道对ATP的敏感性可能是不同的［10］。
本研究中，被吡拉地尔激活、格列本脲阻断的钾离子电流在足月组明显大于早产组。表明在早产组动脉导管平滑肌细胞膜上的KATP 通道尚未发育成熟。有人可能会认为在早产组KATP 通道也是存在的，只是被1 mM的ATP所抑制了；但实际上吡拉地尔在3 mM ATP 的条件下仍然可以激活KATP 电流［10，12，13］。
胎鼠动脉导管平滑肌细胞膜电位与文献报道值近似［2］。与张力实验结果一致，由格列本脲引起的膜电位的降低在足月组明显大于早产组。有报道在完整动脉导管，去极化到15 mV可以引起最大收缩的25%的收缩，去极化到21 mV则引起完全收缩。虽然格列本脲对单个细胞膜电位的影响与整体组织的可能有差异，我们的研究也提示了格列本脲引起的去极化在早产组没有足月组明显。
总之，本研究结果表明：在未成熟胎儿的动脉导管平滑肌细胞膜上的ATP依赖的钾离子通道是未发育完善的。本研究结果支持ATP依赖的钾离子通道是动脉导管平滑肌细胞膜上的血氧感受器之一的假设。也支持在早产儿KATP的发育不成熟是在其动脉导管观察不到氧诱发的收缩现象的原因之一的假设。
【参考文献】
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作者单位： 1 100730 北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院儿科
2 日本东京，日本东京女子医科大学 日本心脏血压研究所 循环器小儿科
（编辑：黄 杰）