体外培养的人鼻腔黏膜纤毛摆动频率的测量*

　　【摘要】  目的  为人鼻腔黏液纤毛运输系统的研究提供科学有效的方法。方法  人鼻腔黏膜的组织块培养法，应用显微高速成像技术测量纤毛摆动频率。结果  在25℃，体外培养的人鼻腔黏膜纤毛摆动频率是10.39±1.80Hz；同一细胞任意两点纤毛摆动频率是相同的；同一来源的体外培养的钩突和下鼻甲的纤毛摆动频率是相同的。结论  钩突可成为今后人鼻腔纤毛系统的研究的主要标本来源。

    【关键词】  人鼻腔上皮细胞；纤毛摆动频率；钩突

     Ciliary beat frequency measurement of cultured human nasal epithelial cells

    SONG Xiao-hong，ZHANG Luo，HAN Demin，et al.Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Beijing Tongren Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing，100730，China

    【Abstract】  Objective  To explore a scientifical method to research human mucociliary system.Methods  Explant culture of human nasal epithelial cells. Ciliary beat frequency was measured by digital high-speed microscope. Results  Ciliary beat frequency of cultured human nasal epithelial cells is 10.39±1.80 Hz at 25℃. Ciliary beat frequency of different cilia is equal on the same cell，it is also equal from uncinate process and inferior turbinate. Conclusion  Mucosa of uncinate process is the main source to research human nasal mucociliary system.

    【Key words】  Human nasal epithelial cells；ciliary beat frequency；uncinate process

    呼吸道黏液纤毛运输系统为呼吸道防御系统的第一道防线，可将进入呼吸道的灰尘等异物排出体外，它是呼吸道能否发挥正常生理功能的重要保障［1］。相邻纤毛的协同运动构成了特有的异相波（metachronal wave）来推动黏液的运输，纤毛摆动频率（ciliary beat frequency，CBF）是反映纤毛运动功能的主要指标，也是反映呼吸道黏液纤毛运输系统功能是否正常的重要指标。因而纤毛摆动频率的测量对了解黏液纤毛运输功能有着非常重要的意义。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  人鼻腔钩突和下鼻甲黏膜。

    1.2  主要试剂  培养基选择达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）；Hanks平衡盐溶液（Hanks' balanced salt solution，HBSS）；羟乙基哌嗪乙磺酸［4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazine ethanesulfonic acid，HEPES］。

    1.3  试验器械和仪器  直径15mm的圆形盖玻片；CO2培养箱；倒置式研究型显微镜；高速数码摄像采集系统：包括高速数码摄像机、图像捕捉卡、图像采集软件和图像灰度分析软件。

    1.4  方法

    1.4.1  人鼻腔纤毛上皮细胞的组织块培养  采用改良的Dirksen，Zhang等介绍的方法［2，3］。无菌操作下取人鼻腔钩突和（或）下鼻甲黏膜，在解剖显微镜下分离黏膜，去除黏膜下组织，把分离好的黏膜面向上，切成0.5～1mm2的组织块，种植在铺有鼠尾胶原的盖玻片上，加入DMEM/NaHCO3，放入37℃含5％CO2的孵箱中，隔日换液1次，培养6～10天时可以进行观察。

    1.4.2  应用数字化高速显微摄像系统测量体外培养的人鼻腔纤毛摆动频率  观察培养好的纤毛上皮细胞的纤毛摆动频率，把盖玻片从培养板中取出，放置在载物台上特定的加药槽内，加入sHBSS，倒置相差显微镜下放大400倍进行观察，培养的人鼻腔纤毛上皮细胞的图像（如图1）通过高速数码摄像采集系统输入小型计算机工作站，每秒钟可采集240帧图像，每次采集3秒钟，通过特定的软件对纤毛中段3×3像素的区域（见图1）进行分析，通过分析所选区域的灰度值变化，计算纤毛摆动频率。

    1.4.3  测量同一细胞不同部位两点的纤毛摆动频率  随机抽取体外培养的人鼻腔纤毛上皮细胞25个，选取同一细胞不同部位纤毛中段的任意两点，测量其纤毛摆动频率。室内温度控制在约24℃。 图1  倒置显微镜下纤毛上皮细胞图像×400，白色网格分隔的是纤毛上皮细胞，左侧细胞纤毛上的白色区域为所选择分析区域（3×3像素），右下角的横线代表5μm随机对照设计，统计学方法选用配对样本t检验，P<0.05。

    1.4.4  测量同一病人体外培养的钩突和下鼻甲黏膜的纤毛摆动频率  选用同一病人的钩突和下鼻甲黏膜进行原代培养，随机选取体外培养的钩突纤毛上皮细胞和下鼻甲纤毛上皮细胞，测量其纤毛摆动频率。室内温度控制在约23℃。随机对照设计，统计方法选用独立样本t检验，P<0.05。

    2  结果

    2.1  体外培养的人鼻腔黏膜纤毛摆动频率的测量  选取体外培养的人鼻腔黏膜纤毛上皮细胞108个，应用数字化显微高速成像技术，在大约25℃时，测量的纤毛摆动频率为10.39±1.80Hz。

    2.2  测量同一体外培养的纤毛上皮细胞不同两点的纤毛摆动频率  随机抽取的同一体外培养的人鼻腔纤毛上皮细胞任意两点的纤毛摆动频率基本是一样的，两者之间存在一定的相关性，相关系数=0.908，P=0.00。同一细胞任意两点的CBF差异无统计学意义，t=1.415，P=0.17（见表1）。 表1  同一细胞任意两点的纤毛摆动频率

    2.3  测量来源相同体外培养的钩突和下鼻甲纤毛上皮细胞的纤毛摆动频率  从表2可以看出，对于标本来源相同体外培养的钩突和下鼻甲纤毛上皮细胞，测量二者的纤毛摆动频率是一致的，差异无统计学意义，t=-0.087，P=0.931。 表2  体外培养的下鼻甲和钩突黏膜的纤毛摆动频率

    3  讨论

    3.1  高速数字化显微成像技术  本研究采用的是高速数字化显微成像技术，通过研究级倒置相差显微镜观察纤毛运动时光学信号的变化，经过高速摄像机、电荷耦合器件和高速图像捕捉卡，以240帧/秒的速度采集图像，然后用特定软件对纤毛运动的灰度变化进行分析，可以更精确地观察纤毛的运动周期。克服了以往的目测法，光电观察法等测量的不精确性，而且可以用来评估纤毛的摆动方式［4，5］。我们应用Zhang和Sanderson研发的高速数字化显微成像系统测量体外培养的人鼻腔纤毛摆动频率，代表了本领域研究的前沿［6，7］。

    3.2  同一体外培养的人鼻腔黏膜上皮细胞任意两点纤毛摆动频率  体外培养的同一细胞，任意两点测量的纤毛摆动频率是一样的，说明这种体外培养人鼻腔黏膜纤毛上皮细胞的培养模式是可行的，其基本保证了原有的纤毛协同运动的状态，取同一细胞的任意一点测量纤毛摆动频率，都可代表这一细胞纤毛的整体运动状况，可为今后纤毛运动相关研究提供一定的理论依据。

    3.3  同一标本来源体外培养的人鼻腔钩突和下鼻甲黏膜上皮细胞  国内外对人鼻腔黏液纤毛运输系统功能状态的研究，无论是传统的糖精试验或现代的光电法测量纤毛摆动频率，其研究的主要区域在下鼻甲，而现代鼻内镜外科技术要求我们尽量保留正常的黏膜组织，这就使本研究所介绍的技术受到了相当的限制。通过本课题的研究，可以考虑用钩突黏膜代替下鼻甲的黏膜来进行纤毛运动方面的研究。常规的鼻内镜外科手术对于钩突黏膜是不保留的；钩突由于其骨质的存在，黏膜下层组织较少，将其中骨质去除而保留粘骨膜的状态下，组织脆性相对较小，更容易分离得到完整的黏膜；钩突较下鼻甲位置更加隐蔽一些，接受外来的刺激相对较少，炎症反应往往较下鼻甲黏膜轻。为今后应用钩突黏膜培养的纤毛上皮细胞来研究纤毛运动状况的可行性提供了理论依据。

    【参考文献】

    1  Sleigh MA，Blake JR，Liron N. The propulsion of mucus by cilia. Am Rev Respir Dis，1988，137（3）: 726-741.

    2  Dirksen ER，Felix JA，Sanderson MJ. Preparation of explant and organ cultures and single cells from airway epithelium. Methods Cell Biol，1995，47:65-74.

    3  Zhang L，Sanderson MJ. Oscillations in ciliary beat frequency and intracellular calcium concentration in rabbit tracheal epithelial cells induced by ATP. J Physiol，2003，546（3）: 733-749.

    4  Zhang L，Han DM and Sanderson MJ. Effect of isoproterenol on the regulation of rabbit airway ciliary beat frequency measured with high-speed digital and fluroescence microscopy. Ann Otol Rhinol Laryngol，2005，114:399-403.

    5  Mark AC and Christopher O'C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax，2000，55: 314-317.

    6  张罗，韩德民，王鸿，等.呼吸道纤毛运动状况的高速数字化显微成像.中华耳鼻咽喉科杂志，2004，39：433－437.

    7  Sanderson MJ. High-speed digital microscopy. Methods，2000，21:325-334.

    *基金项目：国家自然科学基金资助项目（30572026），北京市科技新星资助项目（2003-B-15）

    作者单位： 1 100730 北京，首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉

    头颈外科（Δ通讯作者）

    2 100005 北京，北京市耳鼻咽喉科研究所

　　 （编辑：齐  永）