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【摘要】 目的 利用发酵含有重组质粒PET28a(+)PDC的BL21（DE3）plysS大肠杆菌，获得高效表达的M2蛋白。方法 通过用3.7L发酵罐，37℃培养2.5h，溶氧控制在30%以上,4h后加入IPTG诱导表达6h，并收集菌体。溶解破菌后用安玛西亚金属螯合层析系统纯化目的蛋白。结果 3.7L发酵罐工程菌，菌体收得量可达湿重15g/L。目的蛋白在上清中约占40%～50%，包涵体约占60%～50%。结论 用此方法发酵大肠杆菌，并表达的M2蛋白，为PBC今后的动物模型建立打下了一定的基础。
【关键词】 人源丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位； 胆汁性；肝硬化； 发酵
原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）是一类以肝内小胆管进行性、破坏性炎症为特征的自身免疫性肝病，主要累及中老年妇女。血清线粒体抗体M2（AMA-M2）诊断PBC的敏感性和特异性均超过90%～95%，为本病最突出的免疫学指标异常，也是重要的诊断手段［1］。该抗体是针对位于线粒体内膜上α-酮酸脱氢酶复合物(2-OADC)的自身抗体,并主要和丙酮酸脱氢酶复合物的E2亚单位(pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2)起反应［2］。将PDC表位基因克隆到表达载体PET28a(+)。笔者大量发酵了含有重组质粒PET28a(+)PDC的BL21（DE3）plysS大肠杆菌，对于其培养条件、营养要求、补料方式以及对于重组产物的诱导表达的
基金项目：本课题受国家自然科学基金(30471616)、上海市重大科技攻关基金(04DZ19116)、上海市重点科研支撑条件项目(051409012)和上海市青年科技启明星计划(QMX01423)资助。规律等，都进行了详细的研究和优化。以期获得高效表达的M2蛋白，为今后进一步放大打下基础。1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 工程菌BL21（DE3）plysS大肠杆菌及重组质粒PET28a(+)PDC由本科室构建并保存。获得的菌株复苏后交由上海生物技术工程公司测序。
1.1.2 培养基 一级种子液、二级种子液均选用LB培养基。发酵罐中起始培养基成分（g）：蛋白胨25、酵母提取物 12.5、NH4Cl 2.5、Na2HPO4 15、KH2PO4 7.5，总体积2.5L。补料培养基中含：甘油 100ml、蛋白胨 20g、Na2HPO4 1.8g，加水至200ml。培养基pH全部调至7.0，并加入氨苄青霉素加至100ug/ml。
1.1.3 其他试剂 均为国产分析纯，蛋白纯化仪（安玛西亚中国有限公司）。
1.1.4 主要发酵仪器 Bioengineering公司3.7L发酵罐（第二军医大学生化教研室）。
1.2 细菌培养方法
1.2.1 细菌的发酵 基础培养基组分（蛋白胨、酵母粉）溶解后，加入发酵罐，121℃灭菌30min。冷却后依次加入高压灭菌的30%葡萄糖40ml、1mol/L MgSO4 12ml、二级种子液150ml、0.1mol/L CaCl2 5ml、去泡剂和抗生素，补料培养基的蛋白胨、酵母粉溶于100ml水与100ml甘油混合后高压灭菌待用。
1.2.2 一级种子培养制备 将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)plysS挑取单克隆接种于含有氨苄（60ug/ml）LB液体培养基中，37℃摇床过夜，250r/min摇床过夜，作为活化的一级种子。二级种子培养制备：取一级种子液，以0.2%的接种量转接于150ml含有氨苄的LB培养基中，37℃，250r/min摇床过夜，作为接入发酵罐的种液。
1.2.3 发酵罐分批补料培养 按发酵罐工作体积的5%接入二级种子液，接种后发酵液体积为2.5L，温度控制在37℃。细菌在基础培养基培养2.5h后进行连续恒流补料，补料开始时速度稍快（4ml/min），当加入补料约40ml时放慢速度（1.5ml/min），培养至第4h加入IPTG至1mmol/L，在继续补料的情况下诱导表达，在诱导后1～6h 内间隔1h取样测表达率，补料根据溶氧变化反馈布料。在细菌发酵整个过程中，要根据菌液pH的变化及时补加30%的氨水，控制培养体系pH在6.8～7.4并及时调控搅拌转速及空气流量溶氧在30%以上。
1.2.4 分析方法 细菌生长情况监测：在发酵过程中每 0.5h测定1次菌液浓度，用分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD600），待发酵结束后，发酵菌液以5000r /min在4℃离心30min，PBS重悬菌体2次，称湿重。
1.2.5 M2蛋白的纯化 将获得的湿菌按1:10（W/V）悬浮于结合缓冲液并按每克细菌加8μl 50mmol/L PMSF，置冰浴中以300～400W超声裂解15次，每次10s，间隔30s。离心取上清，用安玛西亚层析系统进行纯化，使用5ml的HisTrap柱，流速控制在3ml/min，压力为0.3Mpa，280nm处紫外监测，记录仪走纸速度为1mm/min，灵敏度1V，纯化过程按照说明书操作，以不同浓度的咪唑平衡液洗柱。
1.2.6 紫外分光光度法测定蛋白浓度 用Beckman紫外分光光度仪，检测纯化后的蛋白溶液在280nm和260nm处的吸光度，以下式估算蛋白浓度：蛋白浓度（mg/ml）=1.55A280-0.75A260。
2 结果
在3.7L发酵罐中，采用不同的诱导时间表达(1h、2h、3h、4h、5h、6h)。结果发现：1h、2h、3h开始诱导表达，细菌密度较小；4h时开始诱导表达，此时的菌体密度已达最大；5h、6h加入IPTG开始诱导，菌体密度已变化不大。说明，细菌培养至4h时，已达细菌生长的对数期。优化诱导时间、诱导时机、补料开始时间以及发酵时间后，培养4h，发现菌体密度最大可达到OD600=8.2左右，相当于细菌湿重15g/L。见表1。表1 不同诱导时间和最终菌体密度关系
2.1蛋白表达情况 发酵至2.5h后，此时溶氧下降速度明显减慢，表明培养基中的葡萄糖已被消耗，细菌生长速度开始下降，所以耗氧下降，开始添加补料。采用恒流补料的方式，速度为1.5ml/min。在发酵过程中，电泳结果显示，以葡萄糖为碳源时的细菌蛋白表达量，明显低于以甘油为碳源的蛋白表达量（图1），因此，笔者之后以甘油为补料添加。用氨水和磷酸调控pH在6.8～7.4之间，溶氧始终控制在30%以上。转速由第1h的300r/min，随着时间依次递增至最后到达500r/min。
2.2 M2融合蛋白表达最佳诱导时间的筛选 重组原核表达质粒PET28a(+)-GNLY在大肠杆菌BL21(DE3) plysS中经IPTG诱导表达，温度37℃，随时间延长，1～2h蛋白表达量逐渐增加，4～5h蛋白表达量即达到最大，如果时间再延长，蛋白表达量反而无明显变化，过夜后，蛋白表达量反而下降。见图2。
2.3 蛋白纯化 蛋白纯化过程中在280nm处有吸收峰，用结合缓冲液进行自动调零，第一个峰是上样过程中流出的蛋白峰，上样完毕后用结合缓冲液冲洗柱子，当峰值回到基线时冲洗结束，此时用洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白。纯化蛋白电泳结果（见图3），纯化后的蛋白浓度为0.8mg/ml。
3 讨论
PBC是一种自身免疫性肝脏慢性炎症性疾病,病理学表现为非化脓性肝内胆管慢性炎症和汇管区淋巴细胞浸润，典型的症状为黄疸、慢性瘙痒和皮肤黄色瘤。近年来,此病在我国的诊出例数呈逐年增多趋势。曾有报道与基因及感染、免疫有关［3，4］。PBC的特征是血中线粒体抗体为阳性，而高滴度的抗线粒体抗体（AMA）是PBC的重要血清学指标。根据其靶抗原不同，AMA可分为M1～M9共9个亚型，其中M2对PBC的诊断最具特异性。该抗体是针对位于线粒体内膜上α-酮酸脱氢酶复合物(2-OADC)的自身抗体,并主要和丙酮酸脱氢酶复合物的E2亚单位(pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2)起反应。
高效重组质粒的构建是基因工程菌技术中最基本也是最关键的一步。笔者利用含重组质粒PET28a（a）PDC的BL21（DE3）plysS大肠杆菌，并用3.7L发酵罐进行了发酵。 此外，诱导时间和诱导时机对工程菌的目的蛋白表达也有较大影响。只有工程菌处于对数生长期，目的蛋白的表达蛋白才是最高的；如果当工程菌进入稳定期后，再加入IPTG，那么目的蛋白表达显著下降。笔者将工程菌活化2.5h后，OD600 nm为1.4时开始诱导，诱导2h后，目的蛋白的表达趋于峰值，但菌体还有继续生长的潜力，诱导6h后，菌体的生长趋于停滞，因此，选择诱导时间为6h，收集菌量和目的蛋白的表达都达到就秒较高水平。
葡萄糖在作为碳源供能时会产生乙酸，乙酸达到一定程度后，会造成菌体生长和产物合成的停止［5］。笔者在发酵起初以葡萄糖作为补料培养基中的碳源，经电泳结果表明，细菌的蛋白表达量明显下降。可能是由于该蛋白表达系统中葡萄糖对乳糖操纵子有抑制作用，所以使得菌体蛋白的表达量显著下降。再以甘油代替葡萄糖后，蛋白表达量明显提高。
用3.7L发酵罐发酵工程菌，菌体收得量可达湿重30g。目的蛋白在上清中约占40%～50%，而包涵体约占60%～50%。用此方法发酵BL21（DE3）plysS大肠杆菌，并高效表达了M2蛋白，为PBC今后的动物模型以及下游纯化提供了可能，并为以后进一步放大打下了一定的基础。
【参考文献】
1 王芸，范红，郭强. 原发性胆汁性肝硬化与抗线粒体抗体M2检测的临床意义.中华现代内科学杂志，2005，2（3）：211-222.
2 Liu HY,Deng AM,Zhang J,et al. Correlation of Chlamydia pneumoniae infection with primary biliary cirrhosis: a study from serological evidence. World Journal of Gastroenterology, 2005，11(26):4108-4110.
3 周晔，刘海英，陈燕，等.原发性胆汁性肝硬化与人白细胞抗原相关性分析.中华消化杂志，2004,24(10)：616-617.
4 刘海英，范列英，屠小卿，等.肺炎衣原体感染与原发性胆汁性肝硬化相关性研究.中华肝脏病杂志，2004，12（3）：183-185.
5 何正祥，张部昌，马清均，等.分泌型重组生长激素工程菌发酵及其产物纯化.中国生物工程杂志,2004，24（10）:47-51.
作者单位： 200003 上海，第二军医大学长征医院实验诊断科，全军临床免疫中心(通讯作者)
(编辑：若 木)