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Home医源资料库在线期刊中华实用医药杂志2006年第6卷第15期

酶联免疫法检测尿本周氏蛋白的初步应用

来源:中华实用医药杂志
摘要:【摘要】目的寻求一种准确、可靠,不需要特殊设备的尿本周氏蛋白的测定方法,以利于在基层医院开展,提高多发性骨髓瘤(MM)的诊断水平。方法用酶联免疫双抗体夹心法检测尿中的本周氏蛋白,并与免疫固定电泳法和热沉淀法比较。结果用酶联免疫法检测20例轻链型,与免疫固定电泳法相比较有85%的符合率,比经典的热沉淀......

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  【摘要】  目的  寻求一种准确、可靠,不需要特殊设备的尿本周氏蛋白的测定方法,以利于在基层医院开展,提高多发性骨髓瘤(MM)的诊断水平。方法  用酶联免疫双抗体夹心法检测尿中的本周氏蛋白,并与免疫固定电泳法和热沉淀法比较。结果  用酶联免疫法检测20例轻链型,与免疫固定电泳法相比较有85%的符合率,比经典的热沉淀法大大提高了检出率。结论  本法简便、准确、可靠,不需要特殊设备,便于基层医院推广,对减少MM的误诊、漏诊有一定的意义。

    【关键词】  本周氏蛋白;多发性骨髓瘤(MM);酶联免疫法

      近几十年来,随着我国人口逐渐老年化,高年龄化社会的出现,以及环境的污染,MM的发病率逐渐升高。MM是一种单克隆性浆细胞恶性增殖和异常聚积为特征的肿瘤,多发于中老年人,在恶性血液病中占10%~15%,大多数具有极高的病死率,该病的主要免役特点是血和尿中出现单克隆免疫球蛋白(即M蛋白),普及和提高M蛋白病检测手段的重要性日益显著,其中尿本周氏蛋白是诊断多发性骨髓瘤的重要实验室依据之一,尿M蛋白测定的众多方法中,以速率散射比浊法,免疫蛋白电泳法为主,具有灵敏、快速、特异性强等优点而被推荐,但这两种方法都需要特殊或昂贵的仪器设备,从而阻碍了在基层医院中的推广。本试验介绍孔宪涛等[1]曾报道用酶联免疫法测本周氏蛋白的方法,并与免疫固定电泳法及热沉淀法相比较,探讨其临床应用价值。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  20例轻链型MM患者的尿液取自南京各医院已确诊的轻链型MM患者,其中男12例,女8例,年龄38~72岁,平均56岁。

    1.2  仪器与试剂  上海Helena ReP电泳仪及其试剂盒(免疫固定电泳用),Benchmark酶标仪为BIO-RAD公司产品,酶联免疫试剂盒为晶美生物工程公司提供,批号为20031208,其他辅助试剂自配。

    1.3  方法

    1.3.1  稀释标本:用pH9.5浓度为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液,将患者尿液1:500稀释。

    1.3.2  分别加稀释后的患者标本和κ标准品,λ标准品,正常混合尿液,各100μl于微板孔中,标本做复孔,同时做空白对照,置37℃ 2h。

    1.3.3  甩干,加封闭液150μl/孔,37℃ 1h。

    1.3.4  甩干,按酶联免疫试剂盒说明规范操作。

    1.3.5  用酶标仪在490nm测OD值,P/N值<2.1或肉眼无色或淡粉红色为阴性。P/N≥2.1或肉眼红色为阳性。

    1.3.6  标本同时做免疫固定电泳和热沉淀法检测尿本周氏蛋白。免疫固定电泳技术(IFE)定性测定:将同一份样本点在琼脂板上的6个不同位置,通过电泳将带有不同电荷的蛋白质分开,然后将IgG、IgA、IgM、κ、λ的抗血清分别加入到各条电泳区带中,如有对应的抗原存在,则会在实验标本的适当位置有抗原抗体复合物形成,并沉淀下来,抗原抗体沉淀区能被氨基黑着色,IFE法敏感性高,易于观察。

    热沉淀法:将一定pH的待测尿液加热至45℃~60℃时,有蛋白开始凝固,继续加热至90℃~100℃时,凝固蛋白重新溶解,再冷至60℃以下,又出现凝固,正常人尿中无此种蛋白,多发性骨髓瘤病人尿液中可出现。

    2  结果

    酶联免疫双抗夹心法,免疫固定电泳法和热沉淀法检测尿本周氏蛋白的结果见表1。表1  三种方法检测尿本周氏蛋白阳性结果的比较

    3  讨论

    免疫球蛋白由一对轻链及一对重链组成,重链有γ、α、μ、δ、ε五种分别对应于IgG、IgA、IgM、IgD、IgE;轻链有两种,每种免疫球蛋白或含κ轻链,或含λ轻链,游离轻链又称本周氏蛋白,是一种多年前有Bence  Jones在一多发性骨髓瘤患者的尿液中发现的,本周氏蛋白在40℃~60℃凝固,温度上升到90℃~100℃时溶解,故又称为凝溶蛋白。

    免疫球蛋白是在B淋巴细胞内合成的,B淋巴细胞有三个基因库,即重链、轻链κ、轻链λ,重、轻链的合成基本上处于平衡状态,轻链的分子量为22KD左右,在血(尿)中以单体或二聚体形式存在,二聚体间以共价二硫键连结或以共价键连结。在正常人血(尿)中有微量的游离轻链,而血中有利轻链的浓度则维持在一定范围[2],肾脏的排泄和分解是清除轻链的主要方式,和其他小分子蛋白一样,轻链从肾小球滤过,约95%的滤过的轻链在近肾小管又被重吸收,并被肾小管上皮细胞分解,非共价键二聚体首先在血浆中分解为单体,因为只有单体才能通过肾小球,滤过的单体在肾小管中又可以再次聚合,并出现在尿中,当细胞分泌轻链与重链不配对或肾功能损害时,血(尿)中游离轻链升高则引发多发性骨髓瘤、自身免疫性疾病、肾源性疾病等[3]。

    多发性骨髓瘤的诊断依靠以下表现:(1)骨髓中浆细胞增多症或组织中出现浆细胞瘤的证据;(2)血和尿中出现本周氏蛋白;(3)多发性骨髓瘤时,由于单克隆B淋巴细胞恶性化增殖引起体液免疫功能发生异常,产生大量单克隆免疫球蛋白(即M蛋白),M蛋白可在血清或尿液中出现,M蛋白重链各不相同,而轻链只有两种(κ、λ),单个免疫球蛋白分子轻链总是同型的,正常时血和尿中两种轻链常维持恒定比例,κ/λ比率约为2.0,κ/λ比率测定对MM尤其是轻链型MM的早期诊断及鉴别诊断有很高价值[4]。

    本试验与免疫固定电泳法相比较其优点是:操作简单,不需要贵重仪器、设备,成本低,可靠性大,阳性率较高,结果显示与免疫固定电泳法相比符合率达到85%,与孔宪涛等报告的基本相符。与传统的热沉淀法相比较,热沉淀法操作简单,但敏感性和准确性太差,而酶联免疫法的阳性率是热沉淀法阳性率的2倍多,大大提高了阳性检测率,降低了漏检率。因此,酶联免疫法检测本周氏蛋白,操作简便、准确,结果可靠,不需要特殊设备,便于在基层医院开展推广,可用于临床上对M蛋白病的诊断、分型和病情监测以及对减少多发性骨髓瘤的误诊、漏诊都有一定的临床应用价值。

    【参考文献】

    1  刘炎,高峰,孔宪涛,等.速率散射比浊法、酶联免疫法检测轻链在多发性骨髓瘤诊断中的意义.中华血液学杂志,1995,16(11):605.

    2  谭立明,彭卫华,王外梅,等.免疫球蛋白及轻链检测在多发性骨髓瘤诊断中的临床意义.江西医学院学报,2003,43(4):32-34.

    3  扶云碧.血(尿)轻链升高的临床意义.国外医学·临床生物化学与检验分册,2002,23(3):151-152.

    4  周京国,张国元,唐中,等.血尿中κ、λ轻链含量及比值对多发性骨髓瘤的诊断价值.华医医学,1999,14(4):46-417.

    作者单位: 1 233000 安徽蚌埠,蚌埠市第一人民医院检验科 

    2 江苏南京,南京鼓楼医院检验中心

  (编辑:齐  永)

作者: 翁翠萍,毕永春
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