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【摘要】 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对骨髓基质细胞（BMSC）体外定向诱导分化时细胞增殖的影响。方法 采用全骨髓法分离大鼠双侧股骨BMSC，传代后培养液中加成骨诱导剂，分为实验组（培养基中加0.05mg/L的bFGF）和对照组（培养基中无bFGF，其余条件相同）进行培养。通过MTT法检测细胞增殖来比较bFGF在大鼠BMSC增殖中的作用。结果 实验组细胞增殖较对照组细胞活跃（P<0.01）。结论 bFGF对BMSC定向诱导分化具有良好的促进作用。
【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子；骨髓基质细胞；增殖
Influence of basic fibroblast growth factor on the growth of marrow stromal cells in vitro
LI Ri-guang, HE Qian, FENG Wen-dao. Wuchuan People’s Hospital, Guangdong 524500，China
【Abstract】 Objective To study the influence of basic fibroblast growth factor（bFGF） on the growth of bone marrow stromal cells（BMSC）. Methods Bone marrow stromal cells（BMSC） were isolated from both femur in Wistar rats using all-bone marrow culture method. After subculture of the cells, the cells were induced to osteoblasts by osteogenic inducer. The bFGF were added into culture medium of bFGF group, and control group were cultured without bFGF. By MTT method, the effect of bFGF on proliferation of BMSC was evaluated in vitro. Results The increase of bFGF group was more active than BMSC group（P<0.01）. Conclusion bFGF has the ability to promote on bone marrow stromal cells proliferation into osteoblasts.
【Key words】 basic fibroblast growth factor;bone marrow stromal cell;proliferation
骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSC）具有多向分化潜能，它可在不同的生物环境和因子的作用下向相应的方向转化，参与细胞再生。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibmblastgrowth factor，bFGF）对体外培养条件下BMSC贴附、增殖、分化的影响仍存在争议，并认为其作用与加入的时间、剂量有关。本实验旨在探讨以BMSC作为骨组织工程的种子细胞进行体外定向诱导培养时bFGF对其增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料 （1）实验动物：Wistar大鼠，雌性，6周龄（合格证书：医动字第14－006号）。（2）主要试剂及仪器设备：青、链霉素，高糖DMEM培养基（GIBCO），胎牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司），胰蛋白酶（AMRESCO），地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、MTT（SIGMA），二甲基亚砜（北京亚太精细化工公司），倒置相差显微镜（OLYMPUS），OG3022A型酶联免疫检测仪（南京华东电子集团医疗装备有限公司），超净工作台（苏净集团安泰公司），SHEL.2300二氧化碳孵箱（日本SANYO），TDL-5离心机（上海安宁科学仪器厂）。
1.2 实验方法 （1）原代细胞培养：颈椎脱位处死大鼠，75%的酒精中浸泡5min后取出，无菌条件下取出双侧股骨，经无菌生理盐水漂洗干净后剪除股骨干的两端，暴露骨髓腔，注射器针头插入髓腔，用DMEM培养液冲洗髓腔，冲出的骨髓细胞放于离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，用含10％FBS，青、链霉素各100u/ml的DMEM培养液5ml制成骨髓细胞悬液，以次用8号和4号针头抽吸细胞悬液两次，将细胞过滤为单细胞悬液，计数有核细胞后以2×105 /cm2种植于培养瓶内，37℃二氧化碳孵箱中培养，CO2浓度5%，湿度95%。3天后首次换液，以后每隔3～5天换液1次。（2）传代细胞培养：原代细胞培养12～16天细胞生长融合，吸出培养液，用37℃ 1×PBS洗细胞2次，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞5min，镜下观察细胞变形后立即加入含有10%的FBS的DMEM终止细胞的消化过程。吸管吹打贴壁细胞，使细胞完全脱离瓶壁，吹打成细胞悬液，吸出置于离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，重新加入DMEM培养液，吹打重悬细胞，依次用8号和4号针头过滤成单细胞悬液，计数细胞后以5×103 /cm2的密度传代培养，用传3代细胞进行以下实验。（3）培养细胞的诱导分化：传3代BMSC分对照组和实验组，对照组培养液为原代培养液＋50μg/ml维生素C＋10mmol/Lβ-甘油磷酸钠（β-GP）＋10nmol/L地塞米松；实验组培养液为对照组培养液＋0.05mg/LbFGF。
1.3 MTT法测细胞增殖 将传至第3代的细胞以1×104/ml的浓度接种于96孔培养板中，每孔200μl，各实验组和对照组均36孔样本。传代后于第1～6天每天各取6孔细胞，每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，37℃孵育4h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜150μl，振荡10min，于490nm测吸光度（A）值。
1.4 统计学方法 数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS统计软件进行配对t检验，检验水准α=0.05。
2 结果
MTT法测定结果表明：bFGF促进BMSC增殖，与对照组相比较，每天所测吸光度值均有统计学意义（表1）。表1 bFGF对BMSC增殖的影响
3 讨论
骨髓可分为造血及基质两大系统，骨髓的成骨能力来源于基质系统。BMSC也叫间充质干细胞［1］，是近年来发现的一种易于扩增、具有多种分化潜能的细胞。有实验证实造血干细胞能分泌生长因子及促贴壁物质，促进BMSC的贴壁和生长［2］，因此本实验在参照了Pereira等［3］的BMSC分离方法的基础上，采用国内常用的全骨髓法分离培养BMSC，通过更换培养液的方式去除悬浮生长的造血细胞。虽然单核细胞和破骨前体细胞可能在最初的贴壁细胞中混杂，但因这些细胞的生长需要1,25（OH）2VitD3或集落刺激因子，所以它们一般在原代培养末期就基本消失了，即使有少量留存也会经传代而去除［4］，因此可获得均一性较高的BMSC。由于骨髓中有核细胞种类很多，密度各不相同，进行密度梯度离心时很容易丢失BMSC。本实验采用的全骨髓培养法不仅避免了梯度离心造成的BMSC的丢失，而且使分离时间缩短，污染机会减少，细胞成活率提高。我们培养的原代细胞贴壁生长10～14天便可融合成片，细胞主要为长梭形。
bFGF是一种毛细血管增殖刺激剂，能促进毛细血管向骨移植物中长入，加速需要血供的软骨内化骨，从而增加成骨量，加快成骨速度。研究表明，经培养的牛骨细胞能够分泌bFGF，并存储于骨细胞的细胞外基质中，能够促进骨组织的新生，对骨与软骨的发生有着重要的凋节作用［5］。在众多的生长因子中，bFGF对BMSC具有最强的促增殖作用［6］，bFGF不仅能提高BMSC的增殖速度和寿命，且能在增殖过程中保留BMSC的多向分化潜能［7］。bFGF对BMSC的生物效应是复杂和多方面的，可以作用于BMSC的粘附、增殖和分化等多个环节。本研究结果显示，合适剂量bFGF对BMSC有促增殖效应。
骨髓成骨是一个非常复杂的过程，需要许多生长因子、激素的凋节和相互作用。保持正常良好的体外培养条件，使BMSC多量稳定地向成骨细胞转化，对骨组织形成具有重要作用。体外培养的正常体细胞，只有用外源生长因子刺激才进行分裂增殖，如果缺乏适当的生长因子，则停止增殖。本实验显示bFGF是有效的促增殖剂，因此这一性质可以用于骨组织工程的研究工作。
【参考文献】
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3 Pereira RF, O’Hara MD, Laptev AV, et al. Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998,95:1142-1147.
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7 Tsutsumi S, Shimazu A, Miyazaki K, et al. Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF. Biochem Biophys Res Commun, 2001,288:413-419.
作者单位：524500 广东吴川，吴川市人民医院