参蛇花痔疮栓中苦参碱含量测定方法的研究

【摘要】  　　目的建立参蛇花痔疮栓中君药成分苦参碱含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-无水乙醇-水（20∶30∶50）（每1000ml加三乙胺0.1ml）为流动相；流速为1.0ml/min；检测波长为208nm。结果本法平均回收率98.29%(n=6)。结论建立了一种操作简便、重复性良好的高效液相色谱法测定参蛇芪痔疮栓中苦参碱含量，该法可用于参蛇花痔疮栓的质量控制。

【关键词】  参蛇花痔疮栓　苦参碱　含量测定　高效液相色谱法

　　【Abstract】ObjectiveHPLC method was developed for the determination of matrine in Shenshehua zhichuang suppository.MethodsUsed HPLC,the analytical column was a Phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm,5μm)column;The mobile phase was acetonitrile-absolute alcohol-water-triethylamine(20:30:50:0.01);The flow rate was 1.0ml/min;and the UV detection wavelength was 208nm;ResultsThe average recovery of the method was 98.29%(n=6).ConclusionThe proposed method would be used in the quantitative analysis of matrine.And the method is covenient,economical and accurate with good reproducibility.Therefore,it can be used for the quality control of Shenshehua zhichuang suppository.

    【Key words】Shenshehua zhichuang suppository;matrine;assay;HPLC

    参蛇花痔疮栓为本公司研制的、用于治疗风伤肠络、湿热下注所致内痔、外痔和混合痔临床疗效较好的中药复方制剂，由苦参、黄柏、蛇床子等9味中药材制备而成，其中苦参、黄柏为君药，因此笔者选定苦参有效成分苦参碱、黄柏有效成分盐酸小檗碱作为指标性成分，进行参蛇花痔疮栓含量测定方法的研究。鉴于篇幅，此处仅说明苦参碱的含量测定研究。本方法操作简便，专属性强，重复性良好，可作为参蛇花痔疮栓新药研究中临床前质量标准的含量测定项。

    1仪器与试药
   
    高效液相色谱仪：Agilent 1200高效液相色谱仪（四元泵，自动进样器，惠普色谱工作站，真空脱气机）（美国安捷伦公司）；Biofuge离心机；苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号0805-200005）；参蛇花痔疮栓样品：来自本研究院自制，批号为06081501、06081701、06081901；苦参碱阴性样品：来自本研究院自制，批号为06101001；试剂：甲醇为美国Tedia色谱纯，其他试剂均为分析纯。

    2方法与结果

    2.1色谱条件色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈-无水乙醇-水（20∶30∶50）（每1000ml加三乙胺0.1ml)；流速：1.0ml/min；检测波长：208nm。理论塔板数按苦参碱峰计算，应不低于6000。

    2.2对照品溶液制备取苦参碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液即得。

    2.3供试品溶液制备取重量差异项下的样品，剪碎，取其碎粉约2g，精密称定，置烧杯中，于50℃水浴上加热使熔化，加氯伤10ml溶解，转移至分液漏斗中，用约50℃的 0.1mol/L的盐酸溶液振摇提取5次，每次均为10ml，合并提取液，滴加5%氢氧化钠溶液调节pH值为8.5左右，离心，将上清液转移至分液漏斗中，用少量的水（pH值已调至8.5左右）洗涤残渣两次，离心，合并离心液，加氯仿振摇提取5次，每次均为15ml，合并提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取得。

    2.4阴性对照溶液的制备按供试品溶液制备方法，制得缺苦参的阴性对照溶液。

    2.5线性范围的考察精密称取苦参碱对照品22.25mg置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，使成含苦参碱0.89mg/ml的母液；分别移取母液1ml、3ml、5ml、7ml、9ml，分别置于5个10ml量瓶中，加甲醇至刻度，照含量测定色谱条件，分别量取上述5份溶液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以溶液浓度（C）为横坐标量，峰面积（A）为纵标进行线性回归，即得线性方程：A=2708.16×C-2.35,r=0.99996；表明苦参碱在0.089~0.801mg/ml范围内线性关系良好。

    2.6干扰试验分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，供试品溶液中苦参碱达到基线分离，阴性对照溶液无干扰，基线稳定，如图1~3。

    图1对照品图谱图2阴性样品图谱图3样品图谱2.7稳定性试验取同一供试品溶液，分别于日内（0、2、4、6、8、10、12、24h）测定其含量，计算日内差，RSD为0.89%，表明样品24h稳定。

    2.8精密度试验精密量取同一供试品溶液20μl注入液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱峰面积，苦参碱平均峰面积为1218.5，精密度RSD为0.67%。

    2.9重复性试验对同一批样品（批号：06081501），按供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，照含量测定项下色谱条件进行测定，记录峰面积，苦参碱平均含量为0.96mg/g，RSD为2.17。

    2.10加样回收试验精密称取参碱对照品24.65mg置50ml量瓶中，用氯仿溶解至刻度，得0.943mg/ml的苦参碱对照品氯仿溶液，备用。另取样品（06081501）约1g，置烧杯中，加入苦参碱对照品氯仿溶液2ml，按供试品溶液制备方法制备6份加样回收供试溶液，照含量测定方法进行测定，计算回收率，平均回收率98.29%，RSD为1.73%。

    2.113批样品含量测定照样品制备方法制备3批样品溶液，每批6份，分别精密吸取供试品及对照品溶液20μl，注入液相色谱仪进行测定，3批含量测定结果分别为0.94mg/g（06081501）、0.91mg/g（06081701）、0.99mg/g（06081901）。

    3讨论

　　本试验旨在对参蛇花痔疮栓中主要有效成分苦参碱含量的测定方法进行研究，以制定新药临床前研究的质量标准。在HPLC方法建立过程中，笔者参考相关文献，摸索其色谱条件，所用过的流动相及检测波长分别为：乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10），220nm［1］；乙腈-无水乙醇-0.1mol/L磷酸溶液（93∶3.5∶3.5)，205nm［2］；乙腈-水-三乙胺（3∶97∶0.2)，208nm［3］;乙腈-无水乙醇-水（80∶10∶10）用磷酸调节pH为2.0，220nm［4］；乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钠（85∶15），210nm［5］；均不能很好的分离主峰与杂质峰。

【参考文献】
  1国家药典委员会中华人民共和国药典（一部）北京：化学工业出版社，2005，141.

2屠万清，李向阳，张留记HPLC测定抗妇炎片中苦参碱的含量中成药，2006，28（7）：1076.

3刘敏，赵海HPLC测定杀菌止痒洗剂中苦参碱的含量中成药，2006，28（7）：1072.

4陈佩，闰红霞HPLC法测定苦参碱栓剂中苦参碱的含量.西北药学杂志，2006，21（4）：150.

5梁燕明高效液相色谱法测定山豆根中苦参碱的含量化工技术与开发，2006，35（7）：27-28.

(编辑：黄杰)

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