补肾固齿丸对人牙周膜成纤维细胞分泌TGF-β1的影响

【摘要】  　　目的研究补肾固齿丸水提液对人牙周膜成纤维细胞(PDLCs)TGF-β1分泌水平的影响，以及在内毒素存在的条件下其分泌水平的改变。方法原代培养人牙周膜成纤维细胞培养液中加入内毒素和不同浓度的固齿丸水提液，在0、2、4、6天不同时间点用ELISA试剂盒检测培养上清液中的TGF-β1水平。结果最高和较高剂量药物组TGF－β1的分泌水平明显高于其他组（P<0.05）,在含有内毒素组中，最高药物剂量组的TGF－β1水平高于对照组，结果差异具有显著性（P<0.01）。结论补肾固齿丸能在一定程度上改变PDLCs分泌TGF-β1的水平，内毒素存影响药物对PDLC的作用。

【关键词】  补肾固齿丸 TGF－β1 内毒素 ELISA

　　The effect of Guchiwan on the secretion level of TGF-β1 of human PDLC

    DONG Wei, JIANG Yin, WU Ya-fei,et al.Huaxi Stamatology Medical College,Sichuan University,Chengdu 610041,China

    【Abstract】ObjectiveTo study the secretion effect level of transforming growth factor β1(TGF-β1) induced by administration of extracts from Guchiwan, a traditional Chinese medication, on human periodontal fibroblast in vitro with endotoxin. Methods Cultured PDLCs from human teeth were stimulated with LPS and different concentrations Guchiwan extracts. ELISA kit was used to detect TGF-β1 level of different test groups at different time. ResultsA higher level of TGF-β1was observed at the two highest concentration groups of Guchiwan(P<0.05). In addition, there was a significant difference in the TGF-β1 levels between thr highest concentration group and the other medication groups or the contaol group (P<0.01) in the existence of LPS.Conclusion This study indicates that Guchiwan can influence the secretion level of TGF-β1 from PDLC, which may be less distinct in the existence of LPS.

    【Key words】bushenguchi pill;TGF-β1;endotoxin;ELISA

    牙周病是在致病菌和宿主免疫反应失衡的情况下发生的感染性疾病。多种炎性介质和细胞因子参与了牙周病的发生发展过程。TGF－β是一种多肽生长因子，TGF－β1是其重要的亚型之一。TGF－β1能调节牙周组织的免疫应答；促进牙周组织的损伤修复，对牙周膜细胞的增殖和牙周软硬组织的再生起着重要的调节作用，促进牙周膜细胞的增殖及DNA的合成，增加成纤维细胞合成胶原及纤维粘连素，减少基质金属蛋白酶和纤溶酶激活剂的合成和结缔组织的破坏；TGF－β1还能通过对牙胚细胞的调控影响牙体牙周组织的早期发育。牙周组织周围的TGF－β1可来源于血小板，也可来自于牙周膜成纤维细胞自身［1］。补肾固齿丸是依照中医牙周病病因“肾虚齿豁”学说指导，根据补肾固齿的原则,在六味地黄丸的基础上增加了骨碎补、青盐、黄芷等药而制成的治疗方剂。经临床研究和动物实验证实该药具有良好的治疗效果，能改善全身及牙周组织状况，增加牙槽骨致密度，减轻牙周组织炎症和破坏［2］。但迄今为止固齿丸治疗牙周病的确切机制尚不十分清楚，已有学者曾经从细菌学组织学酶组织化学等不同角度对其治疗机制进行研究，发现固齿丸能增强健康菌丛的稳定性，维护正常炎细胞功能等多种作用［3~5］。本研究采用体外细胞培养的方法观测补肾固齿丸水提液对人牙周膜成纤维细胞分泌TGF-β1的影响，探讨补肾固齿丸的作用机制，以期为更好地利用天然药物治疗牙周病提供理论依据。

    1材料与方法

    1.1主要药品与试剂高糖DMED培养基（Gibco,美国）；类标准胎牛血清（兰州民海生物）；胰酶（Gibco 美国）；二甲基亚砜（上海药品制剂公司）；青霉素100u/ml ；链霉素100u/ml：TGF－β1双抗夹心ELISA试剂盒(RB分装)；内毒素 E.coli,055:B5(Sigma,德国)；补肾固齿丸水提液（ 九芝堂金鼎药业有限公司）

    1.2仪器相差倒置显微镜(Olympus，日本)；CO2恒温孵箱(Forma，美国)；4℃低温离心机(Jouar，美国)；细胞计数仪（Beckman， 美国）；十二通道加样枪及原装配套加样头（Finnpipette，芬兰）；EL404微量反应板自动洗板机（BIO-TEK, 美国）；HTS 7000 plus多孔板紫外高效分析仪（PE， 美国）。

    1.3方法

    1.3.1补肾固齿丸水提液的制取及消毒按比例取1kg补肾固齿丸混合药物，清洗干燥后，加入适量无离子水熬制，过滤后取上清液，分装后γ射线照射消毒备用。

    1.3.2牙周膜成纤维细胞的原代培养取正畸需要拔除的前磨牙置于含双抗的预冷DMEM中，用锐器刮取牙根中1/3部位的牙周膜组织，经Hank's液反复冲洗后剪碎，加入30~50倍体积的0.5%Ⅰ型胶原酶，37℃消化20min，1000rpm离心10min，弃上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养液洗涤两次后，将组织块转入一次性培养瓶内铺散开并吸去多余液体，倒置于37℃恒温5％CO2恒温培养箱，30min后翻转，加入培养液静置培养。细胞游出后，2~3天换液1次。待细胞铺满瓶底约80%时传代。经免疫组化ABC法进行波形丝蛋白单克隆抗体和角蛋白多克隆抗体染色确定得到的牙周膜成纤维细胞，取第3代生长稳定的牙周膜细胞进行实验。

    1.3.3实验分组及加药将PDLC以4×104密度接种于24孔板，孵育48h后弃去原培养液，PBS清洗2次后分别加药。分为不含LPS（T组）和含LPS组（t组）两大组。T组中按固齿丸水提物在培养液中的终浓度分为T1、T2、T3组（T1 组：含10g/L固齿丸水提物和10％胎牛血清的DMEM培养液,T2 组：含5g/L固齿丸水提物和10％胎牛血清的DMEM培养液,T3 组：含2.5g/L固齿丸水提物和10％胎牛血清的DMEM培养液） ，T0组：为空白对照组，加入只含10％胎牛血清的DMEM培养液。含LPS的 t组分组除LPS在每孔的终末浓度为50μg/ml外,其余与不含LPS（T组）一致。每孔总量为1ml，每剂量复3孔。于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育，在0、2、4、6天吸取培养液上清，4℃低温离心后分装，-20℃低温冰箱冻存待检。

    1.3.4TGF－β1的测定平衡试剂盒至室温后，参照ELISA免疫检测试剂盒说明进行操作，在HTS 7000 Plus 上编制程序，使用标准品在465nm波长处读数得出标准曲线无误后开始正式实验。将上清液复融，各取100μl上清液加入相应孔板，包被后依次加入生物素、浓缩酶联物和显色液。最后由分析仪检测OD值并自动计算转换出样本含量pg/ml。TGF－β1测定结果除以相应的细胞数均值，计算出样本含量pg/104。

    1.4统计学处理结果使用SPSS10.0软件包进行统计学分析，采用随机区组设计资料的方差分析进行组间比较。

    2实验结果

    2.1补肾固齿丸对人牙周膜成纤维细胞分泌TGF－β1的影响见表1。表1不同浓度固齿丸对TGF－β1分泌的影响 统计学分析显示, T1、T2 组分泌量均多于T0 、T3组相应时间点，并且组间差异有显著性(P<0.05)，提示补肾固齿丸对正常PDL细胞分泌TGF－β1有一定影响，但是T3组与T0组比较统计学上差异无显著性,说明在较低浓度的情况下该药物对细胞TGF－β1的分泌量较对照组影响较小，当达到一定的药物浓度范围时，能在一定程度上能影响PDLC的生长。

    2.2补肾固齿丸对LPS刺激下的人牙周膜成纤维细胞分泌TGF－β1的影响在LPS组中，TGF－β1的分泌量只有在t1组差异有显著性(P<0.05)，t2、 t3 组虽然显示出高于t0 组的分泌量差异，但该差异无显著性。将T0、 t0 组进行配对T检验，结果显示两组分泌量差异无显著性。提示LPS影响细胞分泌TGF－β1的作用有限，但对固齿丸影响TGF－β1分泌的效应有一定的拮抗作用，但对较高浓度药物促进有益因子TGF－β1的分泌的拮抗作用较小。见表2。表2 LPS组不同浓度固齿丸对TGF－β1分泌的影响

    3讨论

六味地黄丸是一种被广泛应用于治疗肾阴亏虚各种病症的传统中药，使用历史已经近千年。补肾固齿丸是在六味地黄丸的基础上增加了骨碎补、青盐、黄芷等药而成。1985年，张举之等人报道了固齿丸治疗青少年牙周病的临床研究，发现在未经基础治疗的33例符合肾虚齿豁辨证的青少年牙周炎患者中16例出现了全身状况改善，牙槽骨致密度增加和骨质增生的现象，龈炎指数、牙周病指数下降幅度较对照组大，并且1年后炎症复发率也低。其疗效远远优于对照螺旋霉素组［6］。目前，很多研究证实牙周组织中正常水平的TGF－β1具有促PDLC增殖效应［7］。本实验中发现的药物浓度最高组（10g/L）出现了明显的抑致IL－6分泌的倾向，同时施用药物后细胞分泌TGF－β1水平也出现一定变化，高药物剂量和较高药物剂量（10g/L与5g/L）组细胞分泌TGF－β1较低药物剂量组和空白对照组水平出现了明显的增高，差异具有显著性(P<0.05)，证实了该药物在一定程度上能影响PDLC的生长。过去的研究结果显示除了秋水仙素和细胞松弛素B (cytochalasin B) ［8］可以增加PDLC分泌TGF－β1的水平外 ，釉基质蛋白可以刺激人PDLC分泌TGF－β1和IGF-I［9］，马志伟等的实验也发现，釉基质蛋白对PDLC内源性TGF－β1分泌具有促进作用 ［10］。结合长期的临床观察中发现固齿丸有一定的降血压、降血糖的作用，但实验发现该药物并没有刺激β细胞分泌胰岛素的功能，IGF-I可能就是其降低血糖的原因之一。是否固齿丸通过和釉基质蛋白类似的作用途径来影响PDLC分泌TGF－β1还需要更多的实验来证实。目前，牙周致病菌外膜成分脂多糖(lipopolyaccharied.LPS)已经被认为是一种确定的导致牙周组织破坏的毒力因子，对人牙周组织的主体细胞－成纤维细胞有明显的细胞毒性作用，抑制成纤维细胞的生长。而且，LPS作为一种高活性免疫原，作用于免疫活性细胞和成纤维细胞，引起各种细胞因子的合成和释放，加重牙周组织的炎性反应。笔者前期实验发现，LPS能影响固齿丸作用下PDLC分泌IL－6的水平［11］。在本实验中将T0、 t0 组进行配对T检验，结果显示两组分泌量差异无显著性，与Yamaji等［12］的实验结果一致。但在加入了固齿丸药物的实验组中发现，LPS能改变药物对PDLC分泌TGF－β1的作用，它能够上调PDLC对药物有益作用的反应性，影响TGF－β1受药物作用后的分泌增加。TGF－β1的分泌量只有在最高药物剂量组与对照组差异有显著性(P<0.05)。是否固齿丸某一作用环节受到了LPS转导途径的影响，LPS成为固齿丸诱导PDL细胞分泌TGF－β1的竞争抑制剂还需要更多的研究来证实。Taylor CC 曾经发现LPS能抑制离体大鼠卵巢颗粒细胞分泌雌二醇,对孕酮的分泌量却无影响［13］，在对固齿丸的临床实验中发现患者唾液中雌二醇水平明显升高，而孕酮含量降低。表明LPS影响固齿丸对机体分泌TGF－β1的水平也有可能是通过和性激素相同的途径来调节的。本实验以TGF－β1为检测指标，观察中药补肾固齿丸是否通过影响PDLC分泌TGF－β1发挥作用。结果可以看出：固齿丸能在一定程度上影响PDLC分泌TGF－β1的水平，这种影响在LPS存在时受到抑制，其治疗牙周病的作用机制可能与此相关，但具体作用途径还有待于今后深入研究。

【参考文献】
  1Fujita T, Shiba H. Differential effects of growth factors and cytokines on the synthesis of SPARC, DNA, fibronectin and alkaline phosphatase activity in human periodontal ligament cells.Cell Biol Int， 2004，28(4):281-286

2张举之. 固齿丸治疗青少年牙周炎的临床研究华西口腔医学杂志，1985， (1): 27-31

3吴娅菲. 用暗视野显微镜监测牙周病的治疗:兼论固齿丸治疗机理. 中华口腔医学杂志，1990，25(1): 48-50

4胡琳. 固齿丸对糖尿病大鼠实验性牙周炎组织病理学改变的影响. 现代口腔医学杂志，1991，(3): 142-146

5胡琳. 固齿丸对动物实验性牙周炎酶组织化学改变的影响. 中华口腔医学杂志，1992，27(2): 84-87

6张举之. 固齿丸治疗牙周病机理探讨 华西口腔医学杂志，1990，(3): 198-200

7吴织芬，董广英. 转化生长因子和胰岛素对人牙周膜细胞增殖的影响. 中华口腔医学杂志1997，32（5）：300－302

8Nahm DS,Kim HJ. In vitro expression of matrix metalloproteinase-1, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and transforming growth factor-beta1 in human periodontal ligament fibroblasts.Eur J Orthod，2004，26(2):129-135.

9Okubo K，Kobayashi M. Participation of endogenous IGF-I and TGF-beta 1 with enamel matrix derivative-stimulated cell growth in human periodontal ligament cells. J Periodontal Res， 2003，38(1):1-9.

10马志伟，吴织芬. 釉基质蛋白对人牙周膜细胞内源性TGF－β1分泌的影响. 牙体牙髓牙周病学杂志，2003，12(3):135－137

11姜茵，董伟，吴亚菲，等.补肾固齿丸对人牙周膜成纤维细胞分泌IL-6的影响. 华西口腔医学杂志，2006，24(4)：380-381

12Yamaji Y, Kubota T. Inflammatory cytokine gene expression in human periodontal ligament fibroblasts stimulated with bacterial lipopolysaccharides. Infect Immun，1995，63(9):3576

13Taylor CC,Terranova PF. Lipopolysaccharide inhibits in vitro luteinizing hormone-stimulated rat ovarian granulosa cell estradiol but not progesterone secretion. Biol Reprod，1996，54(6):1390-1396.

(编辑：余强)

作者单位：610041 四川成都，四川大学华西口腔医学院