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【摘要】 目的 建立鸡血藤的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法测定了原儿茶酸的含量， C18色谱柱（250mm×4.6mm, 5μm），流动相为甲醇-水-冰醋酸（25:75:0.2），流速1.0ml/min，检测波长260nm。结果 原儿茶酸与样品中其他组分分离效果较好，原儿茶酸在31.1～93.3μg范围具有良好线性关系，相关系数 r = 0.9996； 平均回收率为99.49%,RSD为1.58%（n=6）。结论 采用此法测定鸡血藤中原儿茶酸的含量，准确可靠，可用于该药材的质量控制。
【关键词】 鸡血藤 原儿茶酸 高效液相色谱法
Detemrmination of constituents for procatecuic acid in spatholobus suberectus dunn
YANG Nai-jia，HUO Xin，LIU Wen-Wei，et al. Guizhou Institute of Biotechnology Research and Development, Guiyang 550002,China
【Abstract】 Objective To establish the method of detemtemine for Spatholobus suberectus Dunn.Methods HPLC method was developed for the determination of protocatechuic acid in Spatholobus suberectus Dunn. The separation was performed on C18 column with methyl alcohol-water- HAC（25:75：0.2） as a mobile phase where the flow rate was 1.0mL/min. The detection wavelength was set at 260 nm.Results A satisfactory separation between protocatechuic acid and impurity was obtained. The calibration curve was linear over the range from 31.1～93.3μg， r = 0.9996； The average recovery was 99.49% , and RSD为1.58%（n=6）.Conclusion The method was accurate and can be used for the detemrmination of constituents for Spatholobus suberectus Dunn.
【Key words】 spatholobus suberectus dunn;protocatechuic acid;HPLC
鸡血藤为豆科植物鸡血藤Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎，别名血风藤、大血藤、血风、活血藤。鸡血藤为常用活血化瘀中药，具有补血、活血、通络作用【1】。《中国药典》收载了1 个种，主要分布在广西、云南、贵州等地，鸡血藤可极显著的使环磷酰胺致贫血小鼠的红细胞值、血红蛋白值和白细胞值上升【2】，能扩张外周血管,增加器官血流量,实验证实对犬股动脉有明显扩张作用【3】，对免疫系统具有双向调节作用【3】,能降低血脂、抗动脉样硬化作用【4】。鸡血藤中含有多种化学成分，但《中国药典》中并无含量测定方法，为此，笔者采用HPLC法测定了鸡血藤药材中原儿茶酸的含量，方法简便、灵敏、准确，对鸡血藤药材的质量鉴定有一定的参考价值。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：岛津LC-10A液相色谱仪，
SPD-10A紫外检测器，南宁威玛龙色谱工作站，HT-230A柱温箱。色谱柱为Diamonsil（TM） 钻石C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；LIBROR AEL-160型万分之一电子分析天平；DS-250A（功率）型超声清洗仪。原儿茶酸对照品（批号：809－200102）购自中国药品生物制品检定所； 鸡血藤药材产自广西、云南、贵州，由贵州大学生物与科学学院生物系关平教授鉴定为Spatholobus suberectus Dunn的干燥根茎。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸（25:75:0.2）为流动相；检测波长为260nm。理论塔板数按原儿茶酸峰计算应不低于3000。对照品与样品色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取原儿茶酸对照品适量，加酸性水（100ml水中加1mol/L的HCL 0.5ml）制成每1ml含3μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液制备 取本品细粉1g，精密称定，加水回流2次，每次20ml，滤过，合并滤液并浓缩至约2ml，加入甲醇10ml，滤过，滤液挥干，再加入乙酸乙酯20ml和 1mol/L的盐酸0.5ml，超声30min，滤过，滤液挥干，残渣加20ml酸性水（100ml水中加1mol/L的 HCL 0.5ml）超声5min使溶解，滤过，滤液过微孔滤膜，作为药材供试品。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各l0μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件，以外标法计算含量。见图1、图2。
2．4 线性关系考察 精密量取原儿茶酸对照溶液配制成1、2、3、4、5μg/ml，分别取10μl注入高效液相色谱仪，进行原儿茶酸含量测定，以原儿茶酸峰面积 A 对原儿茶酸浓度 C 进行线性回归，线性回归方程：A=46033C －289.75，线性范围：0.01～0.05μg，相关系数 r = 0.9996。根据实验结果，原儿茶酸在0.01～0.05μg 范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.5 精密度考察 取同一对照品，分别重复进样6次，测定结果，对照品溶液中原儿茶酸RSD=0.50%（n=6）。
2.6 重复性试验 取本品6份，精密称定样品，按【样品含量测定】项下的方法操作，制成供试品溶液，测定原儿茶酸的平均含量为57.48μg/g，RSD为1.76%。2.7 稳定性试验 将供试品溶液在室温下贮存，于0、2、4、6、8h测定，结果样品溶液在8h内稳定， RSD为1.77%。
图1 原儿茶酸对照品HPLC色谱图图2 样品HPLC色谱图2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品共6份，分别加入等量原儿茶酸对照品，照供试品方法制备，测定含量，原儿茶酸平均回收率为98.32%, RSD=1.64%（ n=6） ，结果见表1。表1 原儿茶酸回收率实验结果
2.9 不同产地鸡血藤中原儿茶酸的含量测定 按2. 3项下方法,制备供试品溶液,测定3个产地鸡血藤药材中原儿茶酸的含量,测定结果见表2。
3 讨论
3．1 原儿茶酸属有机酸，极性较大，选择反相色谱法，流动相选择甲醇：水（15：85）的体系，出峰时间较长，且峰形较宽；选用甲醇：水（25：75）的体系，出峰时间适中，峰形仍较宽；故选用甲醇：水：冰乙酸（25：75：0.2）的体系，出峰时间约为9min，峰形尖锐，理论板数达到3000以上，达到分离要求。表2 不同产地鸡血藤中原儿茶酸的
3．2 鸡血藤粉末采用不同提取方法包括 50%、80%甲醇索氏提取4h，50％、80％甲醇回流提取2h，醋酸乙酯超声30min，醋酸乙酯加水（1：1）超声30min，水提取醇沉后乙酸乙酯萃取；发现水提取醇沉后乙酸乙酯萃取的方法，含量较高且分离度也好，但是萃取过程中的重复性差，考虑到有机酸在酸性水中用乙酸乙酯萃取效果较好，试用少量酸性水加乙酸乙酯直接超声的方法，获得了含量较高且分离度也好的结果，最后的定量溶液用酸水不用甲醇也是为了达到较好分离效果而定的。
3．3 由于市售的鸡血藤药材混用品较多，因此制订鸡血藤药材的质量标准是非常必要的，从高效液相结果可以看出，用原儿茶酸检测鸡血藤药材质量是可行的。笔者认为，如果在定性检测芒柄花素的同时，能加上原儿茶酸的含量测定，就能更好的控制鸡血藤药材的质量。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中国药典（一部）.北京：化学工业出版社，2005，134.
2 罗霞，陈东辉，余梦姚,等. 鸡血藤煎剂对小鼠红细胞增值的影响. 中国中药杂志，2005, 30（6）:477-479.
3 崔艳君,陈若芸. 鸡血藤化学和药理研究进展.天然产物研究与开发,2002，15（4）：72-78.
4 王巍.鸡血藤、鬼箭羽和土鳖虫调脂作用的比较.中国中药杂志，1991，16（5）：299-301.
作者单位：550002 贵州贵阳，贵州省生物技术研究开发基地