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【摘要】 目的 建立喘可治注射液细菌内毒素检查法。方法 采用《中国药典》2005年版附录细菌内毒素检查法。结果 喘可治注射液经8倍稀释后,用灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂检查细菌内毒素无干扰因素的影响。结论 用细菌内毒素检查法检查喘可治注射液中内毒素是可行的。
【关键词】 喘可治注射液;细菌内毒素;热原；鲎试剂；干扰试验
The study in bacterial endotoxins test for Chuankezhi injection
Deng Xiao-hong.Guangzhou Perfect Set Medicines Led,Guangdong 510663 ,China
【Abstract】 Objective To establish bacterial endotoxin test for Chuankezhi injection using limulus lysate test. Methods The maximum valid dilution （MVD） was determined according to inhibition test, the bacterial endotoxin test was based on the method from Chinese pharmacopeia 2005 edition.Results Chuankezhi injection has no interference to the bacterial endotoxin. Conclusion The results suggest that the bacterial endotoxins test is suitable for the detection of endotoxin in Chuankezhi injection.
【Key words】 chuankezhi injection solution; bacterial endotoxin;pyrogen; limulus lysate reagent; interfere test
喘可治注射液是由广州健心药业有限公司生产的中药二类药，为中药注射剂,具有温阳补气、平喘止咳、抗过敏、增强体液免疫与细胞免疫的功能等功效。目前，其质量标准提高的热原检查申报的资料为家兔法，本实验参照《中国药典》2005年版“细菌内毒素检查法”、“细菌内毒素检查法应用指导原则”,对喘可治注射液应用鲎试剂进行细菌内毒素检查代替家兔法的可行性进行研究。现报道如下。
1 实验材料与试剂
1.1 受试药物 喘可治注射液（批号:20050903;20061102;20070302），规格:2ml/支,广州健心药业有限公司生产,试验前热原检查均符合规定。
1.2 试剂 细菌内毒素工作标准品（CSE）：中国药品生物制品检定所，规格100EU/支，批号2005-10。鲎试剂（TAL）：（1）湛江安度斯生物有限公司，规格0.1ml,批号0708201,灵敏度0.25EU/ml;（2）厦门鲎试剂实验厂有限公司,规格0.1ml,批号070814,灵敏度0.25EU/ml。细菌内毒素检查用水（BET水）：湛江安度斯生物有限公司，规格5ml/支,批号0709240, 灵敏度＜0.003EU/ml。
1.3 仪器 DKB－8A型电热恒温水槽,XH-B型漩涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）
2 限值的确定
根据公式:L=K/M。式中L为细菌内毒素限值；K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5 EU/（kg·h）；M为每小时内每公斤体重人的最大给药剂量，本品为4mL/（60kg·h） （喘可治注射液说明书:肌肉注射。成人：一次4ml,每日2次），计算L=5×60/4=75EU/ml。
3 实验
3.1 鲎试剂灵敏度复核实验 按照《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法规定［1］,进行鲎试剂的标示灵敏度复核,结果见表1。
3.2 干扰实验预实验 喘可治有效稀释倍数（MVD）的计算:公式MVD=L/λ。其中L为喘可治的细菌内毒素限值75EU/ml,λ为鲎试剂标示灵敏度,则喘可治的对应有效稀释倍数为: MVD=L/λ=75/0.25=300倍［2］。实验操作:将喘可治注射液用BET水分别2、4、8、16、32倍稀释,将此系列浓度溶液记为NPC。
同时在上述喘可治注射液稀释液中加入细菌内毒素标准溶液,使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素,记此系列溶液为PPC。
取灵敏度为0.25EU/ml的两个不同厂家的鲎试剂,分别与上述PPC和NPC进行反应,每一浓度重复两管,并设阳性和阴性对照。结果见表2。表1 鲎试剂灵敏度复核实验 注：2批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查λc与λ一致,结果均符合规定。表2 喘可治注射液干扰预实验 由以上预干扰实验结果可以初步了解:两个厂家鲎试剂对喘可治注射液的细菌内毒素的试验结果均在2倍以上稀释时无抑制干扰。
3.3 正式干扰实验 为了最终确认是否存在抑制因素的影响,进行以下正式干扰实验。中药注射剂由于提取、精制过程较复杂,流程长,易引入热原。为了确保实验的更切实进行，取喘可治注射液用BET水分别进行1→8稀释,按《中国药典》2005年版二部附录中的细菌内毒素检查供试品干扰实验项进行实验,结果见表3。表3 喘可治注射液正式干扰实验由表3可知，细菌内毒素标准溶液的λ值在0.5λ～2.0λ（λ=0.25 EU/ml）范围内，3个批号的供试品溶液的λ值均在0.5ES～2.0ES之间，符合《中国药典》2005年版对细菌内毒素检查有效性的规定。说明供试品在该浓度（1→8）下对鲎试剂无干扰作用。
4 样品细菌内毒素检查
取喘可治注射液3批，用BET水配制成（1→8）的溶液，然后用λ=0.25EU/ml的鲎试剂实验，按《中国药典》细菌内毒素检查法,使用两批不同厂家的鲎试剂分别对样品进行细菌内毒素检查,并设供试品阳性对照（2λ）、阴性对照和阳性对照（2λ），每种药液平行做两管，结果见表4。表4 样品细菌内毒素检查由表4可见，供试品管和阴性对照管均为阴性，阳性对照管和供试品阳性对照管均为阳性，3个批号供试品的细菌内毒素检查结果均符合规定。
5 讨论
5.1 由预干扰实验结果可以初步发现喘可治注射液在2倍以下稀释浓度有抑制性干扰,稀释至2倍以上浓度后则与鲎试剂反应无干扰作用,且两个厂家生产的鲎试剂反应结果一致。
5.2 正式干扰实验，当选择1→8倍稀释样品浓度时,本实验选择的所有产品用不同厂家的鲎试剂,结果表明Es/Et均在0.5～2.0范围之内,确无干扰影响。
5.3 检查
5.3.1 喘可治注射液3批经药检所热原检查法检查均符合规定，与细菌内毒素检查结果一致。
5.3.2 从以上实验结果看出，本品选用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂, 制备浓度至8倍稀释后,用细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的:取本品,依法检验,每1ml喘可治中内毒素含量应小于75EU。
【参考文献】
1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典，二部.北京: 化学工业出版社，2005, 附录XIE85.
2 中国药品生物制品检定所编. 中国药品检验标准操作规范. 北京: 中国医药科技出版社，2005,287.
作者单位：510663 广东广州，广州健心药业有限公司