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【摘要】 目的 建立人体血清样本中伏立康唑含量检测方法。方法 色谱柱为依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；检测波长:258nm。结果 伏立康唑在0.14～13.96μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，r=0.998。结论 实验建立的HPLC方法可以用于血清样本中的伏立康唑含量检测。
【关键词】 伏立康唑 血清样本 HPLC 含量测定
【Abstract】 Objective To establish a method to determinate the voriconazole content in human serum samples.Methods Eliter C18 column （200mm×4.6mm,5μm） was used with the mobile phase of water-acetonitrile-acetic acid-triethylamine （64:36:0.1:0.05）.The flow rate was 1.2ml.min-1and the wave-length was 258nm. Results The calibration curve was linear in the range of 0.14-13.96μg/ml（r=0.998）.Conclusion The established HPLC method can be used in the determination of voriconazole content in human serum.
【Key words】 voriconazole; serum sample;HPLC;determination
伏立康唑（voriconazole,VRC）是一个三唑类抗真菌药物，其作用机制是抑制真菌细胞色素p450依赖的14α-固醇脱甲基酶，而本品对于真菌细胞色素p450酶比对各种哺乳动物的细胞色素p450酶系统更具选择性。伏立康唑在0.03～64μg/ml的浓度范围内对几乎所有的实验真菌，包括致病性酵母菌和丝状菌属及双芽生菌的分离菌株均有作用。对一些条件致病真菌如曲霉菌属、隐球菌属及念珠菌属包括对氟康唑耐药的克柔念珠菌均有抗菌活性。本实验旨在建立血清样本中伏立康唑浓度检测方法。
1 实验材料
伏立康唑对照品，中检所提供。卡马西平对照品，中检所提供。乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20051120。冰醋酸：分析纯，天津市化学试剂三厂，批号：20061228。三乙胺：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂，批号：20040806。
Waters515高效液相泵，717自动进样器，996紫外检测器，Empower色谱工作站。
2 色谱条件及血浆样本处理方法［1～4］
2.1 色谱条件 色谱柱为依利特C18柱（5μm，4.60mm×200mm）；流动相为水：乙腈：冰醋酸：三乙胺＝64：36：0.1：0.05；流速：1.2ml/min；检测波长：258nm；柱温：室温。
2.2 标准液制备 精密称取伏立康唑对照品0.0340g，加甲醇溶解于50ml容量瓶中并稀释至刻度,即得698μg/ml的伏立康唑对照品溶液。精密称取卡马西平对照品0.0050g，用流动相溶于100ml容量瓶中并稀释至刻度，即得50μg/ml的内标溶液。
2.3 血浆样品的处理 取血浆0.2ml，内标10μl（卡马西平50μg/ml），混匀，再加入0.5ml甲醇，旋涡振荡0.5min，16000r/min离心5min; 吸取上清液100μl进样。3 方法学研究
3.1 专属性 在选定的色谱条件下，伏立康唑与内标卡马西平完全分离，且峰形良好，两者保留时间分别约为 8.4min和5.4min，空白血浆、空白血浆加药物及内标、含药血浆加内标按4法处理后，色谱图见图1。Ⅰ: 空白血浆；Ⅱ: 空白血浆加药；Ⅲ:含内标血浆；IV：2号受试者用药后2h色谱图
A：卡马西平, B：伏立康唑
图1 伏立康唑色谱图3.2 标准曲线及线性回归方程 用伏立康唑对照品溶液（698μg/ml）配制标准曲线工作液：将698μg/ml对照品溶液依次用流动相稀释，得到2.79、8.37、27.92、55.84、139.60、279.20μg/ml。
取空白血浆0.19ml分别置于系列试管中，分别加上述标准曲线溶液各10μl，配制成血浆浓度为样，按上0.14、0.42、1.40、2.79、6.98、13.96μg/ml的血浆标述4方法处理血浆样品，测定样品及内标的峰面积，计算其峰面积比值（伏立康唑/卡马西平，A），以峰面积比值A对血浆浓度C进行线性回归分析，求得线性回归方程为： C = 5.117 A +0.024 （w=1/cc），r=0.998。结果表明，伏立康唑血浆浓度在0.14～13.96μg/ml浓度范围内，线性关系良好，血浆样品可进行定量检测的最低浓度为0.14μg/ml。见图2。
图2 伏立康唑血浆标准曲线
3.3 绝对回收率 各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中，5个为一组，分别加入8.37μg/ml（低浓度）、55.84μg/ml（中浓度）、139.60μg/ml（高浓度）伏立康唑对照品溶液10μl。得浓度为 0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆样品。按上述4方法处理血浆样品，进样100μl，记录色谱峰面积。
另外，用纯水代替血浆重复以上步骤，记录色谱峰面积。以此为标准，将两组峰面积进行比较，计算伏立康唑的绝对回收率，结果见表1。
3.4 相对回收率试验 各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中，5个为一组，分别加入8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液10μl，得浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml 的血浆样品。按上述4方法处理血浆样品，进样100μl，记录色谱峰面积的比值。将比值代入标准曲线，与理论值进行比较，计算伏立康唑的相对回收率，结果见表1。
3.5 精密度试验 取空白血浆0.19ml置于离心管中，分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl，按上述4血浆样品处理方法处理后，得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样各15份，按上述4方法处理血浆样品，于同日和连续2日内各进样100μl，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值（A），并按回归方程求出对应浓度，以此计算其日内和日间变异，结果见表2。 表1 回收率试验表2 精密度试验
3.6 稳定性试验 取空白血浆0.19ml置于离心管中，分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl，得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样各20份，分别于配制后立即、室温放置4h后，24h后反复冻融三次和1个月后，按上述4血浆样品处理方法处理，测定样品和内标的峰面积，计算其峰面积比值（A），并按回归方程求出对应浓度并比较测定浓度，以考察样品稳定性。结果见表3。
4 结果
测定血清样品中均匀加入低、中、高对照样品，以评价测定结果的准确性。配制方法：取空白血浆0.19ml置于离心管中分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl，得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样，按上述4血浆样品处理方法处理后，进样100μl，结果见表4。
5 结论
本实验建立起的HPLC检测伏立康唑血清样本含量的方法可行，检测的数据真实可靠，可以作为血清样本中伏立康唑含量测定方法。表3 样品稳定性试验表4 血清样品中伏立康唑检测结果
【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典, 2005版.北京:化学工业出版社,2005，附录：28-30.
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3 G Srinubabu, Ch AI Raju, N Sarath,et al. Development and validation of a HPLC method forthe determination of voriconazole in pharmaceutical formulation using an experimental design. Talanta ,2007,（71）:1424-1429.
4 St'ephanie Chhun, Elisabeth Rey, Agnes Tran,et al. Simultaneous quantification of voriconazole and posaconazole in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultra-violet detection. Journal of Chromatography B, 2007,（40） :001-006.
作者单位：225321 江苏泰州，扬子江药业集团有限公司