高效液相色谱法测定独活寄生丸中蛇床子素的含量

【摘要】  目的　　建立高效液相色谱法测定独活寄生丸中蛇床子素的含量。方法　　采用Hypersil ODS C18（4.6mm×200mm,5μm）色谱柱，甲醇－水（68：32）为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长322nm。 结果　　蛇床子素在0.0279～0.2511μg范围内呈良好的线性关系，r=0.9999，平均回收率为100.19%（n=6），RSD=1.23%。 结论　　所建立的方法稳定、可靠，可为该产品建立质量控制方法提供参考。

【关键词】  高效液相色谱法 独活寄生丸 蛇床子素 含量测定

    【Abstract】　　Objective　　To establish a HPLC method for the determination of osthole in Duhuojisheng pills. Methods　　A Hypersil ODSC18 column（200mm ×4.6mm,5?m）was used with a mobile phase of methanol-water（30：70）.The flow rate was 1.0ml/min and the detection wavelength was 322nm. Results　　The linearity range was 0.0279～0.2511?g（r=0.9999）, the average recovery rate was 100.19% with RSD 1.23%（n=6）.Conclusion　　This method is accurate, reproducible and can be used for the quality control of Duhuojisheng pills.

    【Key words】　　HPLC;Duhuojisheng pill;osthole ;determination

    　　　　独活寄生丸由独活、桑寄生、当归、熟地黄、党参等组成，具有养血舒筋，祛风除湿的功效，用于风寒湿痹、腰膝冷痛等。该药品标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第二册》，缺含量测定项。方中独活为君药,有祛风除湿，通痹止痛的功效，其主要有效成分为蛇床子素［1］，本文采用高效液相色谱法对独活的蛇床子素进行了含量测定研究。该方法稳定、可靠，可为该产品建立质量控制方法提供参考。

    1　　仪器与试药 

岛津LC-10AD高效液相色谱仪（配有SPD-10A检测器，N2000色谱工作站），AE240电子分析天平（梅特勒公司）。蛇床子素对照品（供含量测定用，批号：110822-200406，中国药品生物制品检定所提供），3批独活寄生丸（批号分别为：20060419，20060516，20060523）。甲醇为色谱纯，水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。

    2　　溶液的制备

    2.1　　对照品溶液　　精密称取蛇床子素对照品13.95mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

    2.2　　供试品溶液　　取本品适量，剪碎，取约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率45kHz）40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

    2.3　　缺独活阴性样品溶液　　取缺独活阴性样品，同“2.2”项下方法操作，即得。

    3　　方法与结果 

    3.1　　色谱条件与系统适用性试验　　色谱柱为Hypersil ODS C18（4.6mm×200mm,5μm），流动相为甲醇－水（68：32），流速为1.0ml/min，柱温为25℃。分别精密吸取“2”项下对照品溶液、供试品溶液及缺独活阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按本色谱条件测定。结果蛇床子素理论塔板数为11000以上，蛇床子素与邻近的杂质峰分离度为2.3以上，阴性样品在蛇床子素对照品相同保留时间位置上未见色谱峰，说明方中其他成分对蛇床子素测定无干扰，结果见图1。A.对照品　　B.样品　　C.阴性样品

    图1　　HPLC色谱图3.2　　线性关系考察　　精密吸取“2.1” 项下对照品溶液（0.01395mg/ml），分别吸取续滤液2、6、10、14、18μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得线性方程：Y=113279640X+8513.67 ，r=0.9999，进样量在0.0279～0.2511μg范围内呈良好的线性关系。

    3.3　　精密度、重复性试验和稳定性试验　　按上述色谱条件，精密吸取“2.1” 项下对照品溶液连续进样6次，每次10μl，峰面积平均值为18028286.5，RSD为0.86% ，结果表明精密度良好。按“2.2” 项下方法处理同一批样品（批号：20060419）6份，HPLC分析，进样量均为10μl，含量的平均值为0.2339mg/g，RSD为1.8% ，结果表明重复性良好。精密吸取“2.2” 项下供试品溶液10μl，按上述色谱条件于0、2、4、8、24h进样测定，峰面积平均值为17989353.8，RSD为1.5%结果表明供试品溶液在室温下，24h内稳定。

    3.4　　加样回收试验　　取已知含量的独活寄生丸样品（批号：20060516，含量为0.2316mg/g）6份，每份约1.5g，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液（0.03489mg/ml）各10ml，再按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，HPLC分析，进样量均为10μl，结果见表1。表1　　加样回收率测定结果　
    3.5　　样品的测定　　精密称取3批样品（批号分别为：20060419，20060516，20060523）各3份，每份约3g。按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，HPLC分析，进样量均为10μl，按外标法计算蛇床子素含量，结果见表2。表2　　样品测定结果　

    4　　讨论

    4.1　　流动相的选择　　参考文献［1］，实验中考察了两组流动相系统：甲醇-水、乙腈-水，结果表明以甲醇－水（68：32）为流动相时，蛇床子素峰基线分离，且峰形较好，故选择流动相为甲醇－水（68：32）。

    4.2　　提取方法的选择［1］　　比较超声提取与回流提取，发现蛇床子素提取率相差不大，因超声提取供试品溶液所含杂质较少，且方法简单，便于操作，故选择超声提取。曾实验了甲醇和稀乙醇提取，结果甲醇优。考察了甲醇溶剂量（25，50，75ml），结果选择甲醇50ml。考察了提取时间（20，40，60min），结果选择40min 。

【参考文献】
  1　　国家药典委员会.中华人民共和国药典,2005年版一部.北京：化学工业出版社，2005，185-186.

作者单位：421001 湖南衡阳,衡阳市疾病预防控制中心