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【摘要】 目的 对头孢替坦二钠进行凝胶法干扰试验，建立无菌原料药头孢替坦二钠细菌内毒素检查的试验方法。方法 采用2005年版《中国药典》二部附录细菌内毒素检查法。结果 头孢替坦二钠稀释136倍（浓度0.7mg/ml）时对细菌内毒素检查法无干扰作用。结论 使用细菌内毒素检查法检查头孢替坦二钠的细菌内毒素是可行的。
【关键词】 头孢替坦二钠；细菌内毒素；凝胶法；干扰试验
【Abstract】 Objective To establish a method for the determination of bacterial endotoxin of cefotetan disodium for injection.Methods According to the bacterial endotoxin test in Chinese Pharmacopoeia 2005 edition.Results The interference on the determination of bacterial endotoxin can be excluded when cefotetan disodium for injection was diluted 136 times.Conclusion It is feasible to detect the bacterial endotoxin of cefotetan disodium for injection by the method of determination of bacterial endotoxin.
【Key words】 cefotetan disodium；bacterial endotoxin；gelation；interference test
头孢替坦二钠为头霉素衍生物，与青霉素结合蛋白具有很强的结合性，从而阻断细菌细胞壁的合成发挥短时间强效杀菌力。对各种细菌产生的内酰胺酶极为稳定，对β-内酰胺酶产生菌也有强大抗菌作用。对革兰阴性菌和厌氧菌有良好抗菌作用，特别是对大肠菌、沙雷菌属、变形杆菌属、摩根菌属、普罗威登斯菌属、假单孢菌属。为探讨采用细菌内毒素检查法检查头孢替坦二钠的可行性，对头孢替坦二钠中细菌内毒素检查进行了研究。
1 仪器与试药
头孢替坦二钠，批号：050512，050520，050604，050610，规格：1g/瓶，由扬子江药业集团江苏海慈生物药业有限公司提供。鲎试剂，由湛江安度斯生物有限公司生产，批号：0602060，灵敏度（λ）0.25EU/ml，装量0.1ml/支；批号：0607202，灵敏度（λ）0.125EU/ml，装量0.1ml/支； 批号：0603101,灵敏度（λ）0.06EU/ml，装量0.1ml/支。由湛江博康海洋生物有限公司生产，批号：0512027，灵敏度（λ）0.125 EU/ml,装量0.1ml/支。
细菌内毒素工作标准品，批号2007，规格150 EU/支；批号2007,规格120EU/支,中国药品生物制品检定所。细菌内毒素检查用水（BET水），批号0611070，规格50ml/支，湛江安度斯生物有公司。DC3A型干式恒温器，南京三爱斯技术开发有限公司。ZH-2型自动漩涡混合器，天津药典标准仪器厂。
2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核试验 取细菌内毒素国家标准品1支,加入细菌内毒素检查用水稀释制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度）。取各批号鲎试剂18支，各用0.1ml的BET水溶解，其中16管加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液各0.1ml，各内毒素浓度平行做4管；另2管加入0.1ml BET水做阴性对照，将试管中溶液轻轻混匀，封闭管口，垂直放入37.4℃干式恒温器中保温60min后观察结果见表1。表1 鲎试剂灵敏度复核结果从表1可知，各批鲎试剂经过标定，灵敏度均在2.0λ～0.5λ，复核灵敏度λc均在2.0λ～0.5λ，表明各批鲎试剂灵敏度均符合规定。
2.2 细菌内毒素限值确定 样品的最大用量根据药品说明书,人的最大用药量M=2000mg/（60kg·h）=33.33mg/（kg·h），注射剂K＝5EU/（kg·h）。L＝K/M=0.15EU/mg。参照USP25头孢替坦二钠质量标准，将头孢替坦二钠细菌内毒素限值L采用0.17EU/mg进行细菌内毒素检查法的研究。
2.3 干扰试验的预试验 头孢替坦二钠用BET水配制100mg/ml溶液为原液，根据最大有稀释倍数MVD＝CL/λ,则样品的最大有效稀释倍数N为68～283倍，所以分别将供试品原液稀释17倍、34倍、68倍、136倍、272倍的溶液作为供试品溶液。
取细菌内毒素标准品，用BET水稀释制成4λ、2λ的细菌内毒素标准品溶液。用稀释倍数为0.5N的供试品溶液与4λ细菌内毒素标准品1:1混合得稀释倍数为N的供试品阳性对照液取鲎试剂，加0.1ml BET水溶解，再分别加入上述各浓度的供试品和供试品阳性溶液各0.1ml，同时设阴性对照和阳性对照，结果见表2。
由表2可初步确定供试品溶液的最小不干扰稀释倍数N=68倍，则可选用λ≤0.25EU/ml的鲎试剂进行正式干扰试验，由于一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作为干扰试验，故确定干扰试验选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰试验。 表2 细菌内毒素干扰试验预试验结果
2.4 干扰试验 本品最大有效稀释倍数：MVD＝L×C/λ=100×0.17/0.125=136倍。取头孢替坦二钠用BET水溶解，制成浓度为100mg／ml的供试品原液，取供试品原液，加BET水稀释68倍和136倍,制成约0.7mg／ml和1.4mg／ml的供试品溶液。取1支细菌内毒素标准品，用BET水使溶解，置漩涡混合器上混合15min，然后用BET水稀释至4λ、2λ、λ、0.5λ和0.25λ不同浓度的内毒素标准对照溶液（Es）。分别取系列浓度的Es溶液和1.4mg/ml的供试品溶液按1：1的比例混合制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液（Et）。取鲎试剂，用BET水溶解，再分别加入MVD倍的供试品溶液、各系列浓度Et溶液和Es溶液，同时设阴性对照和阳性对照，37℃±1℃孵育60min后观察，结果见表3。表3 供试品正式干扰试验结果
干扰试验结果表明:ES值在0.5λ～2.0λ且Et在0.5Es～2.0Es之间,说明头孢替坦二钠供试品浓度为0.7mg/ml已排除干扰，在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌内毒素检查法。
2.5 样品细菌内毒素检查 取三批头孢替坦二钠适量,用细菌内毒素检查用水溶解，制成每毫升中含头孢替坦二钠约0.7mg的供试品溶液，用鲎剂试剂λ为0.125EU/ml,参照细菌内毒素检查法（《中国药典》2005年版二部附录Ⅺ E）依法检查，每毫升稀释液中含内毒素的量不得过0.17EU，结果见表6。 表4 三批头孢替坦二钠细菌内毒素检查结果
3 讨论
样品预干扰试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数,为正式干扰试验提供依据,从表2预试验结果可知初步确定供试品溶液的最小不干扰稀释倍数N=68倍, 由于一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作为干扰试验，故确定干扰试验选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰试验。用2个生产厂家的鲎试剂和三个批号的样品进行正式干扰试验,从试验结果可知样品溶液浓度为0.7mg/ml时对细菌内毒素检查无干扰。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典，2005年版（二部）.北京:化学工业出版社,2005，附录XI E:85-88.
作者单位：225321 江苏泰州，扬子江药业集团有限公司