大豆异黄酮的体外抗肿瘤作用研究

【摘要】  目的 探讨大豆异黄酮的体外抗肿瘤作用。方法 MTT比色法测定大豆异黄酮对肿瘤细胞增殖反应的影响；观察SI对肿瘤细胞分裂和细胞凋亡的作用。结果 SI能明显抑制MCF-7细胞的体外增殖，即在较低浓度下即可抑制离体培养的MCF-7细胞的增殖能力，该作用呈明显的浓度依赖性（P<0.05），且具有一定的饱和性；SI的IC50为32.0μmol/L。96h时不同浓度SI作用于MCF-7细胞后均可最大抑制该细胞的分裂。结论 SI具有明显的体外抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制仍有待进一步深入探讨。

【关键词】  大豆异黄酮 体外 抗肿瘤

　Studies on anti-tumor effect of soybean isoflavone in vitro

    CHEN Jian, JIANG Sai-ping .The First Hospital Affiliated to Zhejiang University，Hangzhou 310003, China

    【Abstract】  Objective  To discuss the anti-tumor effect of soybean isoflavone （SI） in vitro. Methods  The effect of SI on proliferation of tumor cells was determined with MTT method, and the effects of SI on mitosis and apoptosis were observed. Results  SI could obviously inhibit the proliferation of MCF-7 cells even at a low concentration in vitro, and the effect depended on the concentration of SI （P<0.05）, but had a saturation character.The IC50 of SI was 32.0 μmol/L. Different concentration of SI added to MCF-7 cells could all largely inhibit mitosis of cells.Conclusion  SI has significant anti-tumor effect in vitro, and its mechanism need to be further explored.

    【Key words】  soybean isoflavone; in vitro; anti-tumor

    大豆异黄酮（soybean isoflavone，SI）是豆科植物大豆（Glycine maxL. Merr）的成熟种子［1］，是大豆生长过程中形成的一种次生代谢产物，也是一类重要的非营养素成分。它约占大豆干重的0.3%～1.4%，包括金雀异黄素（genistein，GEN）、大豆甙元（daidzein）及大豆黄素（glycitein）。其中，糖甙结合形式占SI的90%～95%，在体内经胃酸酸解或肠道细菌葡萄糖甙酶分解糖基部分，释放成游离形式发挥生物效应。大豆异黄酮具有广泛的生物效应，具有降低血脂、抗动脉粥样硬化、改善妇女更年期综合征、防止鼻出血、抗炎、改善骨质疏松等功效。近年来多项研究还发现，大豆异黄酮具有抗肿瘤作用，尤其对人类乳腺癌细胞株及前列腺癌细胞株均具有明显的体外抑制作用［2］。本文对从大豆中分离得到的大豆异黄酮的体外抗肿瘤活性及其对癌细胞增殖抑制作用进行了考察研究。

　　1  材料与方法

    1.1  试剂  RPMI1640、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠（1auryl sulfate sodium，SDS）购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑蓝（thiazolyl blue，MTT）购自Sigma公司；酶联免疫检测仪购自美国Bio-Rad公司；大豆异黄酮购自Sigma公司，其中金雀异黄素（GEN）含量>98%。实验前用DMSO溶解配成母液（20mmo1/L），并用RPMI1640完全培养基稀释成系列浓度。

    1.2  细胞培养  雌激素敏感的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞由上海细胞生物所提供。以含10％新生牛血清的RPMI 1640（含青霉素100g/ml和链霉素100g/ml）为培养基，在37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，隔日换液，待细胞进入对数生长期后，弃去上清液，磷酸盐缓冲液冲洗2遍，以0.25％的胰蛋白酶消化（悬浮生长的细胞直接收集），再用磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=7.4）冲洗2遍。最后用RPMI 1640完全培养基将之稀释至浓度为5×104个/ml的细胞悬液备用。

    1.3  SI对肿瘤细胞的体外抑制考察  将培养健康的MCF-7细胞株悬液接种于96孔培养板（美国Costar公司），每孔100μl（含1×104个细胞）。细胞接种24h后加入不同浓度的受试物（每组分别加入终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmo1/L、40μmo1/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L的SI溶液），同时设空白对照（培养基）及溶剂对照（2.5%DMSO），每组5个平行孔，将96孔板移入37℃、5%CO2孵箱培养。72h后用MTT比色法测各孔光密度值。于培养结束前4h各培养孔加入四氮唑蓝（MTT）10μl，培养结束后，离心弃去上清，每孔加入15％ SDS 100μl，过夜。次日用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度（OD）值（测定波长=490nm，参考波长=570nm），计算细胞抑制率。计算公式为：细胞抑制率（％）=（对照组OD值－实验组OD值）/（对照组OD值）×100％。以细胞抑制率对SI剂量作图，绘制剂量效应曲线，并用作图法求出IC50。

    1.4  SI对肿瘤细胞有丝分裂影响的考察  将处于对数生长期的细胞常规消化，以5×104个/ml的密度接种于事先放有小盖玻片的24孔培养板内，同时加入各受试物（每组分别加入终浓度10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L的SI溶液），同时设空白对照（培养基）及溶剂对照（2.5%DMSO），各组设5个平行孔。将24孔板移入37℃、5%CO2孵箱内培养1～5天，每隔24h取5孔，甲醇5ml固定10min，姬姆萨应用液（Giemsa）染色5min，流水冲洗，晾干后封片镜检，各取细胞数多、中、少三个区域观察，每片计数1000个细胞中的分裂相细胞，并计算分裂指数平均值。

    1.5  SI对肿瘤细胞凋亡影响的考察  将处于对数生长期细胞常规消化，以5×104个/ml的密度接种于事先放有盖玻片的24孔培养板内，同时加入各受试物（每组分别加入终浓度10μmo1/L、30μmol/L、100μmol/L的SI溶液），同时设空白对照（培养基）及溶剂对照（2.5%DMSO），各组设5个平行孔。将24孔板移入37℃、5%CO2孵箱内培养48h及96h后，用磷酸盐缓冲液浸洗两次，甲醇5ml固定10 min，弃去固定液，用姬姆萨应用液染色10min。流水缓慢冲去染液，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固，光镜下观察细胞形态。光镜下每片计数1000个细胞中的凋亡小体表达细胞数，按下式计算凋亡指数（AI）：AI（‰）=（凋亡细胞数）/（计数细胞数）×1000。

    1.6  统计学分析  数据用均数±标准差（〖x〗±s）表示，两组间用t检验，多组间数据用单因素方差分析。

　　2  结果

    2.1  SI对肿瘤细胞MCF-7的体外抑制  SI对MCF-7细胞增殖影响的量效关系见图1。由图1可见，SI对MCF-7具有明显的抑制作用。随着SI浓度的提高，体外抑制率也随之提高，但提高趋势逐渐缓慢，说明SI对MCF-7细胞的抑制作用有浓度依赖性（rs=0.983，P=0.001），且具有一定的饱和性。从图1可知SI的IC50约为32.0μmol/L。

　　2.2  SI对MCF-7细胞有丝分裂的影响  不同浓度SI对MCF-7细胞有丝分裂的影响情况见图2。由图2可见，MCF细胞有丝分裂指数随着时间的延长而提高，在96h处达到高峰，之后呈下降趋势。并且随着SI浓度提高，MCF-7细胞有丝分裂指数降低，说明高、中、低三个浓度的SI作用于MCF-7细胞后，对该细胞的有丝分裂具有明显的抑制作用，且具有浓度依赖性，SI浓度越高，抑制细胞有丝分裂作用越强。

    2.3  SI对MCF-7细胞凋亡的影响  光镜下观察经SI处理的MCF-7细胞，可见明显的凋亡形态改变：细胞皱缩，染色质聚集，并沿核周呈块状分布，细胞周围可见多个完整膜包裹的凋亡小体。相同处理时间内凋亡指数随SI浓度的增加而增加（rs=0.972，P=0.001），但是在不同处理时间内（即分别处理48h及96h后），相同剂量组凋亡指数并无明显增加（P>0.05），结果见图3。 图2  不同浓度SI对MCF-7细胞有丝分裂指数的影响

　　3  讨论

　　目前，食物中非营养素成分的抗肿瘤作用研究越来越受到重视，其中大豆异黄酮防治肿瘤作用备受关注。大豆异黄酮是大豆中重要的非营养素成分，近年来研究显示其具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管和防治骨质疏松等作用。1990年6月美国国家癌症研究院组织全美著名学者研讨了大豆的抗癌防癌效果，肯定大豆异黄酮是最佳的天然物质。通过流行病学调查表明，乳腺癌在经常食用大豆的日本发病率是美国的1/4，妇女更年期综合征的发病率为美国的1/3［3］。所以对大豆异黄酮的抗肿瘤作用研究有很实际的意义。本研究采用人乳腺癌细胞MCF-7进行，结果表明，SI能明显抑制MCF-7细胞的体外增殖，即使在较低浓度下亦可明显抑制离体培养的MCF-7细胞的增殖。该作用具有明显的浓度依赖性（P<0.05），且具有一定的饱和性。SI的IC50约为32.0 μmol/L。细胞有丝分裂指数实验也更直观地反映出该抑制作用，高、中、低三个浓度的SI作用于MCF-7细胞后均可抑制该细胞的有丝分裂，96h达峰值。浓度越高，有丝分裂指数越低，同样具有浓度依赖性。不同浓度SI对MCF-7细胞凋亡指数影响表现在随着SI浓度的提高，细胞的凋亡指数越高，但是在不同处理时间内（即分别处理48h及96h后），相同剂量组凋亡指数并无明显改变（P>0.05），其中的具体机制还有待进一步分析考察。虽然大多数文献报道SI具有明显的抗肿瘤特性，然而却有少量文献报道［4］，SI有时具有促进肿瘤增殖的作用。所以SI的抗肿瘤机制和特性仍有待进一步深入考察研究，进而研制开发出有针对性的异黄酮类抗肿瘤药物。

【参考文献】
  1 李琳，钱忠明.大豆异黄酮的药理学作用和保健功能的研究进展.中国药学杂志，2002，37（10）：724-726.

2 This P，Rochefordiere A，Clough K，et al.Phytestrogens after breast cancer. Cancer，2001，8（18）：129-134.

3 Hom Ross PL，John EM，Lee M，et al.Phytoestrogen consumption and breast cancer risk in a multiethnic population：the Bay Area Breast Cancer Study. Am J Epidemiol，2001，154（5）：434.

4 Wietrzyk J，Mazurkiewicz M，Madej J，et al．Genistein alone or combined with cyclophosphamide may stimulate 16/C transplantable mouse mammary cancer growth. Med Sci Monit Br，2004，10（11）：414.

作者单位：310003 浙江杭州，浙江大学附属第一医院