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【摘要】 目的 探讨深低温冻存对软骨细胞抗原性的影响。方法 采用细胞培养技术和流式细胞仪技术研究深低温冻存对新西兰兔关节软骨细胞主要组织相容性抗原（MHC类抗原）表达的影响。结果 正常培养的兔关节软骨细胞MHC类抗原表达的阳性率与深低温冻存1个月、2个月及3个月的兔关节软骨细胞在复苏后MHC类抗原表达的阳性率接近，经统计学分析兔关节软骨细胞的MHCⅠ类抗原表达在深低温冻存前后及冻存不同时间的差异无显著性。结论 深低温冻存对软骨细胞MHC类的抗原性无明显的影响，冻存时间的长短对软骨细胞MHC类的抗原性也无明显的影响。
关键词 低温保藏 软骨细胞 流式细胞术 抗原性 主要组织相容性抗原
The effects of cryopreservation on MHC antigenicity of chondrocytes
Zhu Chao，Li Junzheng，Guo Wanhong，et al.
Department of Otorhinolaryngology，The People’s Hospital of Xincai，Henan463500.
【Abstract】 Objective To investigate the antigenicity of chondrocytes after preservation in deep hypothermia.Methods By means of cell culture and flow cytometry we studied the effect of fluid nitrogen cryopreservation on the exˉpression of MHC antigen of chondrocytes.Results Expression rate of MHC antigen of noncryopreserved chondrocytes and that of cryopreserved chondrocytes was similar.There was no significant difference between cryopreserved and noncryˉopreserved chondrocytes.Conclusion This study proves that cryogenically preserved chondrocytes retain their antigeniciˉty.There were no obviously effects on their antigenicity using cryopreservation.
Key words cryopreservation chondrocytes flow cytometry antigenicity MHC
同种异体软骨细胞是组织工程化软骨种子细胞的重要来源，其移植后的免疫排斥反应是影响移植远期效果的重要因素 ［1］ 。液氮低温保存是同种异体软骨细胞的比较成熟的保存方法。液氮低温保存方法对同种异体软骨细胞的抗原性影响是同种异体软骨细胞构建的组织工程化软骨移植过程中非常重要的问题，同时也是一个有争议的问题，在国内外均未见定量研究。我们采用细胞培养方法和流式细胞仪技术，在细胞水平定量研究低温（-196℃）对新西兰兔软骨细胞抗原性的影响。
1 材料与方法
1.1 主要仪器、试剂和材料 倒置相差显微镜（Olym-pus，日本），CO 2 培养箱（Queue，美国），RPMI-1640培养基（Gibco，美国），Ⅱ型胶原酶（Gibco，美国），胎牛血清（FBS，浙江四季青生物制品公司），胰蛋白酶（Sigma，美国），鼠抗兔MHC类抗原mAb（mouse-anti-rabbit MHC antigen mAb）（本校免疫教研室提供）。使用浓度:PBS（pH7.4，0.01mol/L）50倍稀释;羊抗鼠IgG荧光抗体（goat-anti-mouse IgG FITC）（北京军事医学科学院邦定公司）使用浓度:PBS（pH7.4，0.01mol/L）10倍稀释;流式细胞仪（美国Coulter公司），新西兰白兔（第四军医大学实验动物中心提供）。
1.2 方法
1.2.1 软骨种子细胞分离、冻存复苏及培养 取3周龄新西兰白兔，雌雄不限，取关节软骨，剪切成1mm 3 大小碎块，Ⅱ型胶原酶消化12h左右，过100目不锈钢筛收集软骨细胞，1000r/min离心10min，弃上清，加新鲜RPMI-1640培养液（含20%FBS）重悬细胞，制成细胞悬液，用血细胞计数板计数，台盼蓝染色检查细胞活力为（93±2）%，用于实验。细胞悬液和DMSO分别预冷至4℃，然后混成含10%DMSO的细胞悬液，分别装入冻存管并放入程控冰箱。然后以1℃/min的速度缓慢降温至-80℃后，迅速放入液氮中保存。取冻存1个月、2个月及3个月的软骨细胞置入37℃的水温箱中快速复温。融化后离心（1000r/min），弃去上清液，加新鲜RPMI-1640培养液反复洗涤后，再用RPMI-1640培养液（含20%FBS）制成细胞悬液。将新鲜及冻存复温的软骨细胞分别置于37℃、5%CO 2 、饱和湿度培养箱内培养，48h换新鲜RPMI-1640培养液（含20%FBS）一次。取第2代对数生长期培养细胞，制成细胞悬液。
1.2.2 实验分组及标本制备 实验分成4组:A正常培养（非冻存）的软骨细胞组;B深低温冻存1个月的软骨细胞组;C深低温冻存2个月的软骨细胞组;D深低温冻存3个月的软骨细胞组。调整细胞密度为1×10 8 个/ml，取50μl细胞悬液分别加鼠抗兔MHCⅠ、MHCⅡ类抗原mAb50μl（工作浓度），4℃条件下保持60min，无关抗体对照组加羊抗牛IgGmAb洗涤液洗涤2次后加工作浓度的羊抗鼠IgG荧光抗体，充分振摇，4℃保持30min。洗涤液2ml洗涤2次，1000r/min离心5min，加固定液1ml上流式细胞仪测定。
1.3 统计学方法 所有数据均以（ˉx±s）表示，组间以t检验进行统计学分析。
2 结果
培养的正常软骨细胞与冻存复苏后的软骨细胞MHCⅠ、MHCⅡ类抗原表达差异均无显著性（P>0.05）。冻存不同时间后复苏的软骨细胞MHCⅠ、MHCⅡ类抗原表达差异也无显著性（P>0.05），见表1、表2。
表1 软骨细胞的MHCⅠ抗原表达 （略）
注:A正常培养的软骨细胞组;B深低温冻存1个月的软骨细胞组;C深低温冻存2个月的软骨细胞组;D深低温冻存3个月的软骨细胞组
表2 软骨细胞的MHCⅡ抗原表达 （略）
注:A正常培养的软骨细胞组;B深低温冻存1个月的软骨细胞组;C深低温冻存2个月的软骨细胞组;D深低温冻存3个月的软骨细胞组
3 讨论
目前液氮低温保存方法是细胞长期保存比较成熟的保存方法，但液氮低温保存方法对细胞抗原性的影响是同种异体细胞应用于组织工程中至关重要的问题。此问题上存在两种观点:（1）液氮低温保存方法可以降低细胞的抗原性;（2）液氮低温保存方法对细胞的抗原性没有影响。Fontan等 ［2］ 认为长期低温保存可降低同种异体移植物的抗原性，Shumway ［3］ 也认为只有新鲜的同种异体移植物才能激发宿主的免疫反应。Khatib等 ［4］ 在非近交系大鼠的同种异体主动脉移植中发现液氮低温保存方法并不能使同种异体主动脉移植物对宿主的抗移植物的免疫排斥反应的致敏作用减弱。Cochran等 ［5］ 在移植物的皮下包埋实验中也证明了液氮低温保存方法并不能降低移植物的抗原性。Salomon等 ［6］ 和Yankah等 ［7］ 也在实验中证明液氮低温保存的细胞能表达MHCⅠ类和Ⅱ类抗原，但没有进行定量的对比研究。对于低温冻存对软骨细胞免疫原性的影响更是鲜有报道，总之，大多数学者认为液氮低温保存不能改变移植物的抗原性，但都没有精确定量的分析和研究结果。我们采用流式细胞仪技术，对培养的软骨细胞的MHC类抗原分子的表达进行定量研究，发现液氮低温保存对软骨细胞MHC类抗原分子的表达没有明显的影响。软骨细胞冻存前MHCⅠ类抗原表达率为（90.2±3.2）%，冻存1个月复苏后的表达率为（86.3±2.8）%，两组之间的差异无显著性;软骨细胞冻存前MHCⅡ类抗原表达率为（88.5±3.9）%，冻存1个月复苏后表达率为（84.3±3.2）%，两组之间的差异无显著性，这说明液氮低温保存对移植物的抗原性没有影响。这些都证明了液氮低温保存没有影响移植物的抗原性。总之，液氮低温保存方法不能改变软骨细胞的抗原性，这对同种异体软骨细胞的移植是不利的因素，可见液氮低温保存软骨细胞移植物有明显的优点，同时也有致命的弱点。如何能在保存移植物组织生物活性的同时降低软骨细胞的抗原性有待进一步研究。
参考文献
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（编辑吴 莹）
作者单位:463500河南省新蔡县人民医院耳鼻喉科（现于第四军医大学唐都医院耳鼻喉科学习）
710038陕西西安第四军医大学唐都医院耳鼻喉科（ △ 通讯作者）
300142天津解放军第254医院耳鼻喉科