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【摘要】 目的 建立人扁桃体淋巴细胞的分离培养方法，研究淋巴细胞的表型分布，为外周淋巴细胞的研究提供实验数据。 方法 通过临床外科手术摘除人的扁桃体组织，经过切割、刮细胞、裂解红细胞、过滤和Ficoll梯度离心等分离过程制备扁桃体混合淋巴细胞，通过荧光抗体标记和流式细胞术对混合淋巴细胞亚群的表型CD19、CD4、CD8、CD14、CD83进行分析。 结果 在所分离的细胞中，CD19表型的B淋巴细胞约占细胞总数的50%以上;T淋巴细胞约占30%，其中辅助T细胞（CD4）和溶细胞T细胞（CD8）分别占细胞总数的24%和7%，CD4/CD8值约为3;CD14表型的细胞（主要是单核细胞、巨噬细胞）约占总细胞数的20%以上。CD83表型的细胞（主要是成熟的树突细胞和部分B细胞）占总细胞数的7%左右。同时还观察到在体外培养过程中，混合淋巴细胞的形态和表型分布均发生一定的变化。 结论 本文研究和建立的扁桃体淋巴细胞的分离培养方法操作简单，制备的淋巴细胞具有较长的存活时间。通过表型分析证明，扁桃体淋巴细胞主要以B细胞为主，其次为T细胞。在培养过程中表现分布均发生一定的变化。
关键词 扁桃体 淋巴细胞 分离培养 表型
Isolation and phenotype analysis of lymphocytes of human tonsils
Li Xiujin，Zhong Zhenyu，Liang Shuang
Department of Biotechnology，Environmental and Chemical Engineering College，Yanshan University，Qinhuangdao066004.
【Abstract】 Objective To establish a method for isolating and culturing the tonsillar lymphocytes，analyze the distribution of lymphocyte phenotypes so as to get some experimental data for peripheral lymphocyte research.Methods The human lymphocytes were isolated from the tonsillar tissues of the patients having a clear clinical diagnosis of tonsil sleep apnea.The isolation procedure included cutting and scraping the tonsils tissues，lysing red cells，filtering the cells and separating them by Ficoll density gradient centrifugation.The lymphocyte phenotypes，such as CD19，CD4，CD8，CD14and CD83were analyzed by fluorescent-labelled antibodies and flow cytometry.Results More than50%of the isolated lymphocytes were B cells（CD19），about30%of the cells were T cells including Th cells（24%）and cytotoxic T-cells（7%）.The ratio of CD4/CD8was about3.CD14cells（mainly including monocytes and macrophages）was more than20%.The cells with CD83phenotypes（mainly including matured dendritic cells and some B cells）was about7%.The morphologies and phenotypes of the cells have been changed during cultivation.Conclusion The methods es-tablished in this paper for preparing tonsillar lymphocytes is simple and practicable.The prepared cells have long life-time.The majority of the cells is B cells，about30%of the lymphocytes is T cells.The distribution of the cell phenotypes had been changed during cultivation.
Key words tonsils lymphocytes isolation and culture phenotypes
扁桃体属于周围淋巴样组织，位于人的腭、咽、舌上皮细胞下。由于位置上的原因，扁桃体可经常不断地与吸入和食入的多种物质和微生物进行接触，对激发免疫应答和抵御外来病原起重要作用 ［1～5］ 。分析扁桃体淋巴细胞的表型，对了解周围淋巴样组织亚细胞群的分布以及淋巴细胞在免疫反应中的作用有重要意义。
本文利用由外科手术摘除的人扁桃体组织，经过分离得到的扁桃体淋巴细胞，对此淋巴细胞的表型进行了初步分析，同时分析了在不同培养阶段的淋巴细胞的形态和表型的变化，旨在为研究扁桃体淋巴细胞在免疫上的作用提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料 扁桃体取自外科手术摘除的鼾症者扁桃体（经检查无病理变化）;绿色荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD19、CD4、CD8、CD14和CD83系列单克隆抗体均为Ancell公司产品;Ficoll-Paque为Amer-sham公司产品;RPMI1640、青霉素/链霉素、谷氨酰胺等为Gibcol-BRL公司生产;其他试剂均为Sigma和Merk产品;细胞过滤器（孔径70μm）为BD Bio-sciences产品。
1.2 方法
1.2.1 扁桃体淋巴细胞的分离和培养 ［3］ 将手术摘除的扁桃体放入预冷的RPMI完全培养基（RPMI1640、10%人血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺）中，在无菌条件下将扁桃体从培养基中取出，用PBS洗去组织表面的细胞（主要是红细胞），后将扁桃体放入无血清的RPMI中，用刀将扁桃体组织切成薄片，用刀背刮下薄片中的细胞。后用孔径为70μm的细胞滤器过滤，收集细胞液，离心（400g，5min）沉淀细胞。根据离心后所沉淀的细胞体积，以1∶10的体积比加入37℃预温的红细胞裂解液（Tris-HCl缓冲液:20mMTris，135mMNH 4 Cl，pH7.2），混合，在室温下作用3min，后用5倍体积的PBS洗1次。沉淀的细胞用RPMI悬浮，并按3∶1的比例用Ficoll进行梯度离心（300g，25min），取离心管中间的淋巴细胞层，用RPMI洗细胞2次，后将细胞重新悬浮在RPMI完全培养基中（细胞密度约为1×10 5 /ml），在37℃、5%CO 2 培养箱中进行培养。
1.2.2 淋巴细胞抗原的荧光抗体染色 取分离培养的淋巴细胞，计数（每一染色反应约需1×10 5 细胞），离心沉淀细胞（300g，5min），后将细胞悬浮在100μl完全培养基中，加入1μl相应的绿色荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD单克隆抗体（鼠抗人CD19或CD4、CD8、CD14、CD83抗体），在4℃和避光条件下作用1h。后用PBS500μl洗细胞2次，沉淀细胞用1%多聚甲醛（PFA）200μl悬浮和固定，用流式细胞仪做细胞表型测定。与上述同样方法用基因型相同荧光素标记的抗体（鼠IgG1）对细胞进行染色作为对照。
1.2.3 细胞表型检测及其分析 用流式细胞仪（FACScalibur，Becton Dickinson Immunocytometry Sys-tems）CellQuest软件检测经不同荧光抗体染色的细胞，检测的数据通过WinMDI程序进行表型分析。1.2.4 细胞存活率的分析 用台盼蓝染色法检测培养的细胞，根据活细胞数计算细胞的存活率。
2 结果与讨论
2.1 扁桃体淋巴细胞的分离培养及其形态观察
从扁桃体分离混合淋巴细胞大致分为3步:（1）扁桃 体→切割、刮细胞、过筛→细胞混合液;（2）细胞混合液→加Tris-NH 4 Cl缓冲液除去红细胞→粗制的混合淋巴细胞;（3）粗制的淋巴细胞→Ficoll梯度离心除去死细胞、组织碎片及其残留的红细胞→混合淋巴细胞。不同个体扁桃体的体积有较大的差别，在我们分离5个鼾症患者的扁桃体中，平均每一个扁桃体可以获得2×10 8 个细胞。
将分离的混合淋巴细胞培养在RPMI完全培养基中，在不同培养阶段取细胞进行形态学观察（见图1）。图1结果显示，在培养过程中，混合淋巴细胞的形态有一定的变化。新鲜分离的混合淋巴细胞（图1.1）形态主要以圆形为主;当培养到第5天以后（图1.2），除圆形细胞外，出现较多梭型细胞和不规则或带刺的细胞，个别细胞的体积变大。
2.2 不同培养阶段的淋巴细胞存活率 在不同培养时间取淋巴细胞进行台盼蓝染色，计算存活率（图2）。
图2 不同培养阶段淋巴细胞的存活率（略）
在本实验培养条件下，淋巴细胞在6天内仍可保持85%的存活率。这对进行淋巴细胞功能的研究是十分有利的。
2.3 扁桃体淋巴细胞的表型分析 取不同培养阶段的混合淋巴细胞，分别以FITC绿色荧光素标记的鼠抗人CD19、CD4、CD8、CD14、CD83及其鼠IgG 1 （作为对照）单克隆抗体对细胞进行染色，染色后通过流式细胞仪捕获用不同抗体染色的淋巴细胞，经Win-MDI软件分析，结果见图3。
细胞表型分析结果显示，在混合淋巴细胞中，CD19表型的细胞约占细胞总数的50%以上，已知CD19主要在B细胞和滤泡树突细胞中表达，所以扁桃体的淋巴细胞约一半或一半以上为B淋巴细胞。CD4和CD8分别是辅助T细胞和溶细胞T细胞的表型标志，它们分别占细胞总数的24%和7%，CD4/CD8值约为3，这一比值明显高于正常成年人血液CD4与CD8的比值 ［6，7］ 。CD14主要是单核细胞、巨噬细胞的表型标志，约占总细胞的20%以上。CD83主要表达在成熟的树突细胞和少数B细胞中，这类表型的细胞仅占7%左右。
图3 人扁桃体淋巴细胞的表型分布（略）
在培养过程中，有些细胞亚群的表型发生一定漂移。B淋巴细胞的相对比例有所下降，由第1天的70%降至第5天的53%，减少了近20%。而T淋巴细胞，无论是辅助T细胞或溶细胞性T细胞均没有发生明显变化。值得注意的是带有CD14标记的细胞在培养过程中相对比例有较大幅度的提高，由19%提高到29%，同时CD14的信号有非常明显的提高;这意味着在培养过程中，CD14在相应细胞中表达水平明显增加。CD83表型的细胞在培养过程中也发生一定的波动，由第1天的7%上升到第3天的9%，后降到第5天的3%。
在本实验条件下，分离的淋巴细胞的存活率较高，在培养的第8天仍有80%的细胞存活，这为在体外进行淋巴细胞免疫学研究创造了必要的条件。因为在体外进行淋巴细胞免疫学研究时，细胞对刺激物的应答、细胞与细胞的相互作用都需要一定的时间才能完成。
在体外利用周围淋巴样组织的淋巴细胞进行免疫学研究，常需要从这些组织中分离出处于自然生理状态的淋巴细胞。为保持其细胞的自然特性，在分离和培养过程中，应尽可能减少外部条件，特别是分离液和培养基的某些抗原成分或某些因子，对细胞的刺激。本实验在分离细胞时，没有采用传统的用胶原酶对组织块进行消化，因为实验室常用的胶原酶多数来自于微生物，这类胶原酶对人的淋巴细胞是一种抗原，它会刺激淋巴细胞而影响细胞的自然生理状态。所以我们没有采用胶原酶消化法，而采用直接刮取细胞的方法进行分离。
在分离和培养过程中，本实验采用了RPMI1640这一适合于淋巴细胞培养的基本培养基，同时用同一个体的人血清（10%）代替胎牛血清或小牛血清，这样可减少外源血清对淋巴细胞的刺激，使其细胞尽可能处于自然状态。但在实际上，体外培养的环境与机体的内环境终会有一些差别，在实验中要尽可能缩小这些差别。
由于很难得到健康人的扁桃体组织，所以本实验采用了通过外科手术摘除的鼾症者的扁桃体。因为单纯打鼾的患者扁桃体很少发生炎症，同时通过病理切片检查未发现明显的炎症反应，所以分离的淋巴细胞接近健康人的淋巴细胞。
在体外培养过程中，淋巴细胞的表型发生一定的漂移，这是细胞在培养过程中不同细胞之间、细胞与环境之间相互作用的结果。这些变化是不可避免的，只有了解这些变化，才能在体外实验过程中考虑到这些因素，从而得到比较可靠的实验分析结果。
（致谢:本实验得到新加坡国立大学医学院王德云博士和路金华博士的支持，在此表示衷心感谢）
〔本文图1见封三〕（略）
参考文献
1 Bergler W，Adam S，Gross HJ，et al.Age-dependent altered proportions in subpopulations of tonsillar lymphocytes.Clin Exp Immunol，1999，116（1）:9-18.
2 Yokoi H，Seki M，Okazoe S，et al.The role and expression of CD27and CD70lymphocytes in the human tonsil.Lymphology，2003，36（2）:74-83.
3 Rosenmann E，Rabinowitz R，Schlesinger M.Lymphocyte subsets in hu-man tonsils:the effect of age and infection.Pediatr Allergy Immunol，1998，9（3）:161-167.
4 Eriksson JC，Davidsson A，Garberg H，et al.Lymphocyte distribution in the tonsils prior to and after influenza vaccination.Vaccine，2003，22（1）:57-63.
5 Zidan M，Jecker P，Pabst R.Differences in lymphocyte subsets in the wall of high endothelial venules and the lymphatics of human palatine ton-sils.Scand J Immunol，2000，51（4）:372-376.
6 Tinhofer I，Marschitz I，Kos M，et al.Differential sensitivity of CD4 + and CD8 + T lymphocytes to the killing efficacy of Fas（Apo-1/CD95）lig-and+tumor cells in B chronic lymphocytic leukemia.Blood，1998，91（11）:4273-4281.
7 Currier JR，Stevenson KS，Kehn PJ，et al.Contributions of CD4+ ，CD8+ ，and CD4 + CD8 + T cells to skewing with in the peripheral T cell receptor beta chain repertoire of healthy macaques.Hum Immunol，1999，60（3）:209-222.
（编辑新 竹）
作者单位:066004河北秦皇岛燕山大学环境与化学工程学院生物工程系（△ 通讯作者）
071002保定河北大学生命科学学院（2002级学生）