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【摘要】 目的 探讨转移生长因子-β2(TGF-β2)对猪眼小梁细胞中纤维联结蛋白的mRNA及蛋白质表达的影响。方法 经器官培养法(organ culture)2～3天后，分组的猪眼前段分别注入浓度为0.45 ng/ml(原发性开角型青光眼前房水中TGF-β2的浓度)和0.18 ng/ml(正常人眼前房水中TGF-β2的浓度)的活性TGF-β2，对照眼灌注不含TGF-β2的培养基，将猪眼前节经固定、石蜡包埋和切片，通过原位杂交和免疫组化的方法检测小梁网细胞中纤维联结蛋白的mRNA和蛋白质的表达，对照组采用同样的方法检测。结果 在灌注含有0.45 ng/ml活性TGF-β2的标本中，小梁细胞中纤维联结蛋白的杂交信号和免疫反应强度均呈强阳性，而在灌注含有0.18 ng/ml TGF-β2的标本中，小梁细胞其杂交信号和免疫反应强度均较弱，在对照组中，杂交信号和免疫组化染色呈阴性。结论 TGF-β2对灌注猪眼中小梁网的纤维联结蛋白的mRNA和蛋白质表达起正调节作用，表明猪眼小梁细胞合成的这种ECM（细胞外基质成分，即纤维联结蛋白）被房水中的TGF-β2调节，这个结论和我们以及其他研究者先前的假设是一致的，即浓度升高的活化TGF-β2可能在猪眼的小梁组织发生病理组织学改变中起着重要的作用。
【关键词】 高眼压；纤维联结蛋白；转移生长因子-β2；小梁细胞
Expression of fibronectin mRNA and protein by porcine trabecular cells treated with transforming growth factor-β2
ZHONG Yong，WANG Xiang-yan，SHI Wei，et al.Department of Ophthalmology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing 100730，China
［Abstract］ Objective To observe the effects of TGF-β2 on mRNA and protein expression of fibronectin by trabecular cells.Methods By using organ culture technique，incubated porcine anterior segments were treated with activated TGF-β2 at concentrations present in the aqueous humor of POAG (0.45 ng/ml) and normal (0.18 ng/ml) human eyes.Control eyes treated without TGF-β2.Then the anterior segments were fixed，embedded，and tissue sections were prepared.We used a digoxigenin-labeled cRNA probe and an anti-fibronectin antibody to detec fibronectin mRNA and protein by hybridization in situ and immunohistochemistry，respectively.Negative controls were performed simultaneously.Results With medium that contained 0.45ng/ml of activated TGF-β2，the hybridization signal and immunoreaction for fibronectin were strongly positive in the trabecular cells and meshwork，respectively.In comparison，less immunostaining and mRNA were detected in trabecular cells of anterior segments perfused with medium containing 0.18ng/ml of TGF-β2.No staining or hybridization signal were observed in the negative controls.Conclusion Elevated concentrations of TGF-β2 upregulated the synthesis of fibronectin in the trabecular meshwork of perfused organ-cultured eyes.Our result indicates that the synthesis of this ECM component by trabecular cells is regulated by the amount of TGF-β2 in the aqueous humor，which is consistent with our and other’s previous hypothesis that increased levels of this activated transforming growth factor-β2 is of pathogenetic significance in the histologic changes of the meshwork in the porcine eye.
［Key words］ ocular hypertension;fibronectin;transforming growth factor-β2;trabecular cells
纤维联结蛋白属于细胞外基质组成成分，它是一种具有多功能的糖蛋白，存在于多种细胞和细胞间隙中，并在细胞与细胞、细胞与基质的黏附和细胞扩展中起到重要的作用，并影响细胞的形态，同时它还调节细胞的许多活性，包括细胞骨架的组建、细胞的迁徙、吞噬、分化及凝血、止血。此外，纤维联结蛋白还能够促进细胞增殖和伤口愈合［1］。
免疫组化的方法已经显示纤维联结蛋白存在于小梁网和房水流出通道中，也存在于其他眼组织中。在青光眼患者小梁网中的纤维联结蛋白含量比正常人高，它使得房水输出减少［2］。研究人员还证实转移生长因子-β2（TGF-β2）在青光眼患者的房水中的含量比同年龄组正常人群高［3，4］。此外，我们早期的研究还证明，在TGF-β2作用下，单层体外培养的小梁细胞合成纤维联结蛋白的能力增强［5］。鉴于伦理的原因，我们研究中选用的是猪眼而不是人眼，采用已被以前的实验证实可行的眼前节器官培养技术［6］，我们的研究重心是：在相当于青光眼和正常人房水中的浓度下，TGF-β2通过对小梁细胞合成纤维联结蛋白的影响，从而调节和影响小梁细胞的细胞活性，探讨小梁细胞的功能变化在高眼压状态下所起的作用。
1 材料与方法
1.1 眼前段培养及处理 我们用猪的眼前节器官培养技术(最先由Johnson报道)［6］，被修剪掉结膜和眼外肌的猪眼，用含0.1%抗生素(青霉素和链霉素)及无血清的MEM(改进的Eagle培养基)中清洗3遍后，浸泡于5%的聚维酮碘中，在无菌状态下，从周边赤道部切开眼球。小心分离玻璃体、晶状体、虹膜、睫状体，把前段置于佩特里细菌培养皿中，然后将角巩膜移植物置于特殊的无菌培养皿中并用聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃环密封，将2根21-gauge插管置于培养皿底部并连接两根无菌硅管，用哈佛大学的微量灌流泵，MEM以2.5 μl/min［6］的恒定量通过一根中央插管注入眼中，另一根中央插管前部连接压力换能器用来交换眼前段中的培养基（见图1）。眼内灌流培养基每24 h交换1次，培养皿中的培养基也要每日更新。
猪的眼前段培养2～3天后，分别注入浓度为0.45 ng/ml(在POAG者中TGF-β2的浓度)和0.18 ng/ml(同年龄组正常人中TGF-β2的浓度)活性TGF-β2。用于对照的猪眼灌注没有添加TGF-β2的培养基，7天后，在固定液(4%多聚甲醛和1%戊二醛)中4℃固定12～16h后，石蜡包埋切片。
1.2 免疫组化 组织切片在2%正常羊血清和2%牛血清蛋白进行处理，在4℃的湿房内经家兔的多克隆抗纤维联结蛋白抗体(一抗)浸润12～16 h后，经山羊抗家兔抗体(二抗)培育2 h，内源性的过氧化酶的活性被甲醇中的3%过氧化氢灭活。切片经过辣根过氧化物酶结合的Vectastain试剂盒(Vector，Burlingame，CA)的处理，载玻片封盖后，在光学显微镜下观察。
1.3 原位杂交 由Dr.Akihito Ozawa提供的包含猪的纤维联结蛋白的cDNA的质粒，在Schaeren-Wiemers描述的一种限制性核酸内切酶(Promega Corp.Madison，WI)作用下转为线形DNA，体外转录反应的底物为非放射性元素标记的NTP混合物(Boehringer Mannheim)。正链通过T3 RNA聚合酶产生，反链通过T7聚合酶产生。采用地高辛(DIG)-11-UTP标记的RNA探针，多克隆羊抗－地高辛（DIG）抗体，经过处理后的组织切片放入新鲜配置的颜色基质溶液中［Fast BCIP/NBT缓冲底物(Sigma)］，最后盖上盖玻片后观察显色的情况。
2 结果
2.1 免疫组化 在灌注含有浓度为0.45 ng/ml活性TGF-β2的标本中，小梁细胞中纤维联结蛋白的免疫反应强度呈强阳性。颗粒状反应产物主要位于小梁网及邻近组织中，在深层的角巩膜区域反应物较少见（见图2A）。而在灌注含有0.18 ng/ml TGF-β2的标本中，小梁细胞纤维联结蛋白的免疫反应强度较弱，反应物位于小梁区（见图2B）。在对照组的切片中未观察到明显的免疫着色，偶见小梁细胞染色。
2.2 原位杂交 在灌注含有浓度为0.45 ng/ml活性TGF-β2的标本中，小梁网纤维联结蛋白的反义寡核苷酸探针的杂交信号为强阳性，体现出在细胞内和细胞外（见图3A）的高密度质粒标记，同免疫组化染色的结果相似。而在灌注含有0.18 ng/ml TGF-β2的标本中，小梁细胞纤维联结蛋白mRNA的表达在细胞内和细胞外也可观察到，但其杂交信号强度明显减弱（见图3B）。在阴性对照中反链地高辛（DIG）标记的探针未显示杂交信号，偶见极少的组织染色。原位分子杂交的结果和免疫组化得到的结果相符。
3 讨论
小梁网的细胞外基质构成完整的组织骨架，主要功能是保持小梁组织的结构完整，并在维持房水流出通道的正常生理生化活动中起重要作用。细胞培养显示人类小梁细胞合成和分泌一些ECM的成分，例如在ECM转归过程中起重要作用的各种金属蛋白酶［2，7］。ECM数量和成分的异常直接导致房水流出系统的功能异常，例如增加房水流出阻力，导致房水流出减少，眼内压力增高［2］。在小梁网和Schlemm’s管系统部位的细胞构成的降低和包括纤维联结蛋白在内的ECM组分的堆积已被证明是POAG眼小梁网中最具特征性和一致性的发现，这也意味着其在POAG的发病机制中发挥作用［7，8，9］。
以前的研究证明，由多种细胞介导的ECM生成和转化受成纤维细胞生长因子和TGF-β的影响，其中已证明TGF-β可增强纤维联结蛋白、胶原和蛋白聚糖的生成［5，10］。我们的实验显示，经过TGF-β2（其浓度相当于POAG眼）处理后的小梁网组织中，免疫组化和原位杂交结果均提示纤维联结蛋白合成增加，与我们先前的研究结果相一致，证明TGF-β2与小梁细胞的纤维联结蛋白基因的表达呈正相关［5］。此外，人眼前段的试验研究还发现，ECM的其他组分如多功能蛋白聚糖、肌蛋白和β-晶体蛋白的表达在TGF-β的作用下均增加［8，9］。这个结论证明了无论在猪眼还是人眼，TGF-β2都能促进小梁网ECM的生成。
存在于房水或小梁细胞中的蛋白水解酶如基质降解酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂（TPA）等，在ECM各种成分（如核心蛋白多糖、纤维联结蛋白、Ⅳ型胶原和其他蛋白质）的转化和重塑中起辅助作用［11］。纤维联结蛋白沉积量的增多可能是由于纤维联结蛋白合成的增加或者是由于纤维联结蛋白降解的减少，后者可能是由于TGF-β介导的蛋白水解酶的减少或者金属蛋白酶抑制蛋白的表达增多所致，而TGF-β2如何调节ECM的基因表达以及过多堆积的ECM在增加房水外流阻力方面的确切机制尚不明确。一些研究者提出ECM降解的减少可以降低小梁细胞对调节房水外引流阻力反馈信号的应答能力，或产生错误应答信号，从而使小梁细胞不能维持一个合适的房水外流阻力［7］。另外有学者认为，ECM、纤维联结蛋白可以通过像黏附分子一样发挥作用以及与房水中的生长因子相互作用而影响小梁细胞结构［12，13］，此外ECM还有可能对小梁基质金属蛋白酶有机械的伸展作用［14，15］。
由此可以推测，非青光眼者和青光眼者的小梁细胞的ECM成分的表达和蛋白水解酶有所不同。小梁房水流出系统遇到的阻力主要来自ECM，因此蛋白水解酶在调节房水流出阻力方面也起着重要的作用［7，14，15］。但是，仍需要进一步的研究确证能调节TGF-β2活性的基质降解酶。我们现在的观察结果与我们先前在体外研究的TGF-β2对纤维联结蛋白的产物呈正调节作用的结论相一致［5］。由于小梁细胞间的ECM组分是维持和调节房水流出中基本要素［14，15］，因此，在POAG眼中增加的TGF-β2可能通过调控基因表达的方式来调节小梁网中纤维联结蛋白的表达，从而调整在小梁网区域的房水流出通路的阻力，这提示高水平的活化TGF-β2在高眼压的发生机制中有着重要的意义。
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作者单位：100730 北京，北京协和医院眼科