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【摘要】 探讨三氧化二砷（As2O3）诱导Hep-2细胞凋亡机制及其对细胞周期各时相的影响。方法 应用噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术法检测不同浓度的As2O3对Hep-2细胞的增殖抑制率，细胞周期改变及凋亡率，并通过电子显微镜观察其亚细胞结构改变。结果 As2O3对Hep-2细胞增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，流式细胞术结果显示，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，电子显微镜结果显示，细胞空化，线粒体肿胀，染色质趋边凝集。结论 As2O3对Hep-2细胞有明显的增殖抑制作用，阻止G1期细胞向S期转化进程，诱导Hep-2细胞凋亡。
【关键词】 As2O3 细胞周期 凋亡 Hep-2细胞
近年研究结果证实，肿瘤的发生不仅与细胞增殖周期有关，且与凋亡亦有特殊的生物学意义［1］。因此，探讨细胞凋亡机制及发现新的凋亡诱导剂具有理论和实际意义，As2O3是中药砒霜的主要有效成分，作为药用已有2 400多年的历史，20世纪70年代发现可有效治疗急性早幼粒细胞白血病，进一步的实验研究发现As2O3对其他恶性肿瘤也有作用［2］。本研究以Hep-2细胞为靶系统，体外探讨As2O3对细胞周期变化及其诱导凋亡作用，以期为抗喉癌药物的筛选提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）As2O3为哈尔滨医科大学附属第一医院制备，以磷酸盐缓冲液配制成50 μmol/L储存液，-20 ℃冰箱内保存备用。（2） Hep-2细胞（人喉癌细胞株）由吉林省肿瘤研究所提供。（3）RPMI 1640培养基，MTT试剂为美国Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 MTT比色法 取对数生长期的Hep-2细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，细胞数为2×106/ml，接种于96孔塑料培养板内每孔100 μl，当细胞生长达到80%汇合时，每孔内分别加入不同浓度的As2O3溶液，0 μmol/L、1 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L，每个浓度6复孔，静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h加入酸化异丙醇50 μl/孔，振荡5 min，使MTT还原产物完全溶解，用酶标仪于550 nm波长处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算Hep-2细胞增殖抑制率。Hep-2细胞抑制率=（1-加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值）×100%，结果见表1。
1.2.2 流式细胞术 细胞培养及分组同MTT比色法，不同之处为将96孔培养板改为50 ml培养瓶进行，培养结束后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗二次，70%冷乙醇固定，上机前过4S目网，调细胞数为1×106/ml，上机分析细胞周期的改变及细胞凋亡率，结果见表2。
1.2.3 透射电镜 观察Hep-2细胞超微结构，细胞分组及培养条件同MTT比色法，收集经不同浓度As2O3作用的Hep-2细胞，离心弃上清，将沉淀于管底的Hep-2细胞用2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电镜观察，拍照，结果见图1，2。
1.2.4 统计学方法 随机分组，组间比较用F检验，数据以均数±标准差（x±s）表示。表1 不同浓度As2O3对Hep-2细胞增殖抑制率
2 结果
表1结果表明，不同浓度As2O3对Hep-2细胞增殖均有抑制作用，组间比较差异显著，Hep-2细胞增殖抑制率与As2O3浓度呈正相关（r=0.842）。表2 As2O3对Hep-2细胞周期各时相影响及凋亡率 表2结果表明，不同浓度的As2O3对Hep-2细胞周期均有影响，与对照组相比较差异均显著，随着药物浓度的上升，其抑制率亦上升，但是3 μmol/L与5 μmol/L相比，差异无统计学意义，但有上升趋势。
图1 3 μmol/L As2O3对Hep-2亚细胞结构改变，细胞空化，线粒体肿胀（×5000）
图2 5 μmol/L As2O3对Hep-2 亚细胞结构改变，细胞核破碎，可见凋亡小体（×5000）
3 讨论
近年来，有关细胞周期调控机制及其与恶性肿瘤发生的关系研究进展较快，研究结果表明，化学结构不同，作用靶点各异的抗肿瘤药物，既可以阻滞细胞周期的进程，又可以诱导相应的细胞发生凋亡，而且能否诱导细胞凋亡已成为评价抗肿瘤药物疗效的重要标志［3］。
本研究应用MTT比色法检测As2O3对Hep-2细胞的增殖抑制率，收到了满意的效果，结果显示，As2O3对Hep-2细胞抑制率呈剂量依赖性，抑制率为29%～52%，因为MTT试剂可被哺乳动物细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数量及细胞活化状态呈线性关系，该法是一种检测细胞存活的客观指标，广泛应用于抗肿瘤药物的筛选和细胞毒性实验。
流式细胞仪结果显示，不同浓度的As2O3对Hep-2细胞周期均有影响，与对照组相比差异均显著，但在组间比较时，3 μmol/L与5 μmol/L差异不显著，但是在量上还是有区别的。As2O3可使Hep-2细胞G0/G1细胞阻滞，G0/G1期细胞增多，影响G1期细胞向S期细胞转化进程，致使S期细胞减少，而G2/M期细胞相对增多，在真核细胞周期演进过程中存在一关键过渡点［4］，当其受到外界压力时会限制细胞周期转变，被称为细胞周期检测点，主要有G0/G1期检测点，S期检测点和G2/M期检测点，我们的结果显示，As2O3对Hep-2细胞G1期阻滞，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M相对增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普通反应，这一点从细胞凋亡率上反映更为明显，与文献报道相一致［5］，药物作用后，细胞首先通过S期缓慢，继之阻滞于G2/M期，高浓度时细胞死亡，而死亡的形式是以凋亡为主。因此，本研究证明As2O3为细胞周期特异性药物，主要作用G1期。
此外，本研究还应用电子显微镜观察As2O3作用的Hep-2细胞超微结构改变，细胞高度空化，线粒体肿胀，染色质趋边凝集，可见到凋亡小体改变。
本实验通过多种方法证明As2O3对Hep-2细胞系有较强的诱导凋亡作用，具有剂量依赖性，为As2O3临床应用提供理论依据。
【参考文献】
1 陈立鹤，关伟康.细胞死亡方式研究进展.国际病理科学与临床杂志，2005，25（6）：507-509.
2 郝杰，刘云鹏.三氧化二砷抗肿瘤临床应用进展.国外医学·肿瘤学分册，2004，31（2）：132-134.
3 Bai YQ,Miyake S,Iwai T,et al.COX2,a homelbox transcription factor,upregulates transcription of the P21/WAF1/CIPI gene.Oncogene，2003,22（39）:7942-7947.
4 Bartek J,Lukas J.Mammalian G1 and S-phase checkpoints in response to DNA damage.J Curr Opin Cell Biol,2001,13（6）:738-747.
5 张慧英，孙保存.细胞周期素D1与肺癌研究进展.国外医学·肿瘤学分册，2005，32（8）：602-605.
作者单位：130041 吉林长春，吉林大学第二医院（△通讯作者）