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【摘要】 目的 了解鼻黏膜成纤维细胞中是否存在组胺受体及组胺受体的亚型，比较变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎中组胺受体表达程度。方法 选择5例变应性鼻炎患者作为研究组，5例慢性单纯性鼻炎患者为对照组。选择变应性鼻炎患者与非过敏性患者的鼻中隔手术中切取部分下鼻甲，用鼻黏膜培养成纤维细胞用于研究。首先用RT-PCR方法了解鼻黏膜成纤维细胞中是否存在组胺受体及存在的亚型，然后再用real-time PCR方法在分别用TNF-α、IL-1β及组胺刺激下比较变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎中组胺受体mRNA的表达与比较。结果 证实了鼻黏膜成纤维细胞中只有1型与2型组胺受体。在变应性鼻炎组中1型与2型组胺受体mRNA比慢性单纯性鼻炎组中表达得高，但并没有显著性差异。用IL-1β刺激的情况下1型组胺受体mRNA的表达在慢性单纯性鼻炎组中明显低于变应性鼻炎组，差异具有统计学意义。结论 鼻黏膜成纤维细胞中只有1型与2型组胺受体的表达。在各种细胞因子的刺激下尤其是IL-1β刺激下有效调节变应性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞中组胺受体的表达。
【关键词】 组胺受体;鼻黏膜;成纤维细胞;变应性鼻炎;慢性单纯性鼻炎
Expression of histamine receptor in fibroblast of nasal mucosa in allergic rhinitis and chronic simple rhinitis
CUI Zhe-zhu，WU Zheng-xie，JIN Xiang-hua，et al.Department of Otorhinolaryngology，Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji 133000，China
Objective The objective of this study is to investigate which subtypes of histamine receptors are presented in nasal fibroblast，and to compare the differences of expression between allergic rhinitis and chronic simple rhinitis.Methods Five characterized subjects with allergic rhinitis and 5 non-allergic subjects，as controls，were recruited.For all subjects，the nasal mucosa was taken from the inferior turbinate during the nasal septal surgery.Fibroblasts were cultured from each mucosa.The subtypes of histamine receptor in the fibroblasts were identified by the means of RT-PCR.The expression level of histamine receptors was detected in non-stimulated and stimulated states by TNF-α，IL-1β，and histamine，through real time PCR，respectively.The protein expression of histamine receptors were evaluated in the non-stimulated condition.Results Histamine receptor 1 and 2 were identified in the fibroblasts of nasal mucosa.The allergic group had a trend to express mRNA of histamine receptor 1 and 2 higher，compared with chronic simple rhinitis.But the trend was not statistically significant except some of receptor 2.In the IL-1β stimulated condition，chronic simple rhinitis showed significantly higher expression of mRNA of histamine receptor 1 compared with allergic rhinitis group.Conclusion Histamine may have a role in the nasal fibroblasts via histamine receptor 1 and 2.Various cytokine，especially IL-1β，may affect the action of histamine through the regulation of expression of histamine receptors in the nasal fibroblasts.
[Key words] histamine receptor;nasal mucosa;fibroblast;allergic rhinitis;chronic simple rhinitis
组胺能够对细胞与组织起到各种各样的生理作用，尤其能够引起变应性鼻炎的主要症状。组胺的这种不同功能是通过与细胞表面的组胺受体的结合来完成。到目前为止，人们所了解的组胺受体共有4种类型，分别为1型、 2型、 3型及4型，分布在很多组织与细胞之中[1，2]。1型组胺受体主要是分布在平滑肌细胞、肾上腺皮质、心脏及中枢神经系统中，主要是司理平滑肌细胞的收缩与毛细血管的渗透作用，在机体的过敏反应过程中起着重要的作用。2型组胺受体是主要分布在胃壁细胞, 毛细血管平滑肌细胞、 抑制T细胞、中性粒细胞、中枢神经系统及心脏等部位，当刺激2型组胺受体的时候可以促进胃酸的分泌[1，2]。3型组胺受体主要分布在中枢神经系统、 末梢神经系统等，主要司理以组胺做媒介的神经细胞的前突触受体进行调节作用[2，3]。4型组胺受体主要分布在骨髓、脾脏、末梢血液、 白细胞、 胸腺、 小肠，以及结肠等组织内[4，5]。到目前，对4型组胺受体的免疫功能及生理作用还不是很清楚。成纤维细胞在人体中维持组织的结构，分泌各种趋化因子，即IL-8、粒-巨噬细胞集落刺激因子(CM-CSF) 、嗜酸粒细胞趋化因子、产生炎性细胞因子(IL-1、IL-6)等[6～10]。成纤维细胞的这种功能是从炎症过程中产生的IL-1，TNF-α等的刺激下形成[11]。Kim等[12]认为用组胺刺激变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎的鼻黏膜成纤维细胞的时候变应性鼻炎组的成纤维细胞早期分泌更多的CM-CSF与干细胞因子。这些现象提示鼻黏膜成纤维细胞拥有组胺受体，并且可能在变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎组中组胺受体的表达程度有一定的差异。本次研究的目的是了解鼻黏膜成纤维细胞中是否存在组胺受体，并了解可能存在的组胺受体的亚型，进一步了解在组胺、IL-1β、TNF-α刺激下，变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎的鼻黏膜成纤维细胞的组胺受体的表达的比较。
1 对象与方法
1.1 研究对象 选择变应性鼻炎患者5例为研究组， 慢性单纯性鼻炎5例为对照组。变应性鼻炎的诊断标准是1997年中华医学会耳鼻咽喉科学分会海口会议关于变应性鼻炎的诊断标准[13]。除此之外还做了以下的检查与记录：患者有打喷嚏，瘙痒感，清鼻涕及鼻塞等鼻部症状的同时做了酶免疫法，在MAST过敏原检测系统(HITACHI chemical nondetectable diagnostics, Inc)检查大于或等于(++)以上，皮肤过敏反应检查(allergic skin test,AST)中对粉尘螨(dermatophagoides farinae,DF)或屋尘螨(dermatophagoides pteronyssinus,DP)的皮肤过敏反应检查与作为对照组的比例达100%以上者，鼻部诱发反应检查 (nasal provocation test,NPT) 呈阳性反应者诊断为变应性鼻炎，有鼻涕及鼻塞等鼻部症状的同时做了MAST检查呈阴性，AST检查及NPT检查呈阴性反应者诊断为非过敏性鼻炎患者。以上所有患者分类均符合中华医学会耳鼻咽喉科学分会1997年海口会议制订的AR诊断标准。所有患者术前2周内禁用激素、抗组胺药物等治疗变应性鼻炎的药物，均无吸烟史，合并其他疾病者除外。
1.2 研究方法
1.2.1 细胞培养 鼻中隔手术时切除部分下鼻甲黏膜培养了成纤维细胞。用含有500 U/ml青霉素, 500 μg/ml链霉素, 6 μg/ml两性霉素B (GIBCO, Grand Island, NY, USA) 的PBS冲洗三次后将下鼻甲黏膜切成1 mm3 大小，放置在培养皿中，在室温下放置5 min黏附之后再用含10%进口胎牛血清的DMEM(dulbeccos modified eagles medium)培养基中进行培养。当形成了单层成纤维细胞后除去培养液，再用PBS洗后添加0.05%胰酶，在37 ℃，5%CO2 培养基内处理5 min，使细胞分离。将分离的细胞用含有2%FBS与抗生素的DMEM培养液里浮游进行隔代培养。本实验中应用的是第二代培养的成纤维细胞(图1)。将培养的成纤维细胞分别以3×105个灌注到6孔细胞培养板中，并使细胞黏附于培养容器的底面，为了减少FBS的影响使细胞培养液中的浓度调节为2%。
1.2.2 成纤维细胞的刺激 细胞因子的处理是用含有2%FBS的培养基中分别添加了白介素-1β(IL-1β)(10 ng/ml)，TNF-α(10 ng/ml，R&D Systems, MN, USA)，组胺(×10-7, Sigma, MO, USA)后分别培养12 h、24 h、48 h之后用于RNA的提取。
1.2.3 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) (1)RNA的分离:RNA的分离是依照RNA-Bee溶液的使用方法(Tel-test, Inc, Friendswood, TX, USA)进行了分离。培养的细胞在60 mm培养皿放入1 mm的RNA-Bee进行了溶解。加0.2倍的氯仿混合后冰块上放置5 min，用离心机(Centrifuge 5 402, Eppendrof, Germany)进行离心12 000 g，4 ℃的条件下离心了15 min。收取上清液后放入同等量的异丙醇，在室温下使之沉淀10 min。随后在12 000 g，4 ℃的条件下离心5 min后除去上清液，在沉淀物中加75%的乙醇800 μl后在7 500 g，4 ℃的条件下离心沉淀5 min，随后放在空气里10 min使沉淀物在空气中干燥后分离RNA，将分离的RNA用DEPC-处理过的蒸馏水中溶解。将分离的RNA利用紫外可见分光光度计 (Ultraspec 2 000, Parmacia Biotech, Cambridge, England)以260 nm中测定了RNA的浓度。A260/A280的吸光度比为1.5～1.8，将RNA放置于-70 ℃中保存。(2)RT-PCR:将1 μg的RNA调节到用DEPC-处理过蒸馏水10 μl中。70 ℃温度中加热5 min后又放在冰块上放置5 min。2 μl的10×反应用缓冲溶液(100mM Tris-HCl, pH 9.0, 500 mM KCl, 1% Trition X-100), 取4 μl的25 mM MgCl2、 2 μl的10 mM脱氧核苷三磷酸(dNTP), 取0.5 μl(40 unit/μl)的核糖核酸酶抑制剂, 加入15 unit反转录酶 (Promega, Medison, WI, USA) 后总剂量调节为20 μl。反应条件为42 ℃下1 h，95 ℃下5 min，4 ℃下5 min。实验中使用的组胺受体引物的始发体碱基序列与大小见表1。PCR反应如下;在2 μl cDAN中加5 μl的10×PCR buffer(100mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2), 4 μl的2.5mM dNTP, 20pmol的sense 与antisense的引物，放入2unit的Taq DNA聚合酶( Takara, Shiga, Japan)之后再放入灭菌蒸馏水调节至50 μl。利用遗传因子增幅器(Biometra, Gottingen, Germany)进行了PCR。具体的条件是组胺受体(HR1，HR2，HR3，HR4 与β-actin)初期变性为95 ℃下5 min后，95 ℃下1 min, auuedling是55 ℃下1 min，延长是在72 ℃下1 min内进行了30周期(β-actin是25周期)，最后的延长是72 ℃温度中加热10 min进行了增幅。10 μl的PCR生成物内混合加入2 μl的6×loading buffer(0.25% bromophenol blue, 0.25%xylene cyanol, 30%sucrose) 后再添加了0.5 μg/ml的溴化乙锭后，在2%(gel)琼脂糖凝胶中加0.5×TBE(45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA)后 用90 V电压下电泳1 h，利用1000凝胶成像系统(Gel Doc 1000gel documentation system, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)确定基因带(band)。1型与2型组胺受体的阳性对照组是利用鼻黏膜的上皮细胞，而3型与4型的阳性对照组是利用了人的末梢血液的白细胞。表1 不同亚型的组胺受体底物碱基顺序
(3)实时聚合酶链反应(real-time PCR)：1.5 ml的实验管内加2.4 μl的25 mM MgCl2, 2 μl的包含Lightcycler fast start enzyme的DNA master SYBR green I, 10 pmol的sense 与antisense引物，最终调节至包括蒸馏水在内18 μl。18 μl的混合物中加2 μl的cDNA后分别灌注到毛细管，盖上盖子后在700 g，5 min离心后移到Lightcycler增幅器(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)后逐一放入。1型与2型组胺受体，β-actin的热处理温度为55 ℃，根据PCR生成物的大小将速度调节为25 bp/1 s进行了real-time PCR。1 型与2型组胺受体遗传物的表达程度是计算了与β-actin的相对数据来计算。
1.3 统计学处理 观察了变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞中各型组胺受体的表达，用real-time PCR了解了1型与2型组胺受体表达程度。将目标基因扩增曲线的交叉点与 β-actin 扩增曲线的交叉点值作为受体的表达程度(注：数据越低表达程度越高)并以(±s)来表达。用SPSS 12.0 for Windows 系统对数据进行了统计处理，利用了 Mann-Whitenys U test。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR结果(成纤维细胞组胺受体的亚型的表达) 为了解鼻黏膜成纤维细胞中组胺受体mRNA的表达与否进行了RT-PCR。实验结果1型与2型组胺受体mRNA表达，但3型与4型组胺受体却没有表达(图2)。
2.2 Real-time PCR结果
2.2.1 无刺激状态下1型与2型组胺受体mRNA的表达 无刺激状态下1型组胺受体mRNA的表达在变应性鼻炎组中比慢性单纯性鼻炎组表达得更多，但是并没有统计学上的意义，随着时间的推移，1型组胺受体mRNA的表达越来越增多。2型组胺受体mRNA在变应性鼻炎组中随着时间的推移而逐渐增多，而慢性单纯性鼻炎组中却表达得越来越少，在培养24 h后两组中的表达差异有显著性(P=0.016)，见表2。表2 鼻黏膜成纤维细胞组胺受体在没有刺激的情况下表达程度注：组间比较差异有统计学意义，*P=0.016
2.2.2 用组胺刺激后1型与2型组胺受体的mRNA的表达 用组胺刺激后1型组胺受体的mRNA的表达与2型组胺受体的mRNA表达在两组中都在减少，但是在各组内随着时间的推移其表达程度差异无统计学意义，而且两组间同样的时间内也没有显著性差异，见表3。表3 鼻黏膜成纤维细胞在组胺的刺激下组胺受体mRNA的表达组胺受体
2.2.3 用IL-1β刺激情况下1型与2型组胺受体的mRNA的表达 用IL-1β刺激下1型组胺受体的mRNA的表达在变应性鼻炎组中表达出现明显减少，相比慢性单纯性鼻炎组在12 h(P=0.047),24 h(P=0.009), 48 h(P=0.000)均表现有显著性差异。变应性鼻炎组中并没有因为随时间的推移而呈现明显的减少，而在慢性单纯性鼻炎组中在培养12 h的时候，1型组胺受体mRNA的表达有明显的增多(P=0.016)。2型组胺受体mRNA的表达在变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎两组中差异并无统计学意义，但是在变应性鼻炎组中无刺激的时候随着时间的推移其表达增多，有刺激的时候随着时间的推移其表达有明显减少的趋势，见表4。
2.2.4 用TNF-α刺激情况下1型与2型组胺受体的mRNA的表达 用TNF-α刺激情况下1型组胺受体的mRNA的表达在变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组中并没有明显的表达差异。而2型组胺受体的mRNA的表达只是在变应性鼻炎组在培养48 h变应性鼻炎组比慢性单纯性鼻炎组中的表达有显著增多，见表5。表4 鼻黏膜成纤维细胞在IL-1β的刺激下组胺受体mRNA的表达注：变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组之间组胺受体的表达差异有统计学意义，*P<0.05,**P<0.01;慢性单纯性鼻炎组中用IL-1β刺激的条件下与非刺激的条件下差异有统计学意义，aP=0.016表5 鼻黏膜成纤维细胞在TNF-α的刺激下组胺受体mRNA的表达注：变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组之间组胺受体表达程度的比较，*P=0.047
3 讨论
组胺生成于中性粒细胞与肥大细胞，并参与各种过敏反应。组胺在气道上皮层的微环境中的肥大细胞合成，当抗原被吸入的时候增加气道的渗透作用[14]，在诱导变应性鼻炎反应中起着重要的作用，在过敏反应的初期媒介反应中起着重要的作用[15]。目前，有些学者开始研究有关组胺与人体各种组织中成纤维细胞之间的相互作用，Jordana等[16]认为组胺能够使体外培养的成纤维细胞增殖，并认为这些增殖作用是通过2型组胺受体来完成。Johnson等[17]认为Thymikine能够使体外培养的人的皮肤成纤维细胞增殖，而组胺则通过1型组胺受体促进蛋白激酶C与激活剂的活性来抑制thymikine对成纤维细胞增殖作用，即根据不同部位1型与2型组胺受体对成纤维细胞引起增殖或抑制其增殖作用。鼻黏膜组织中有关组胺受体的研究也有一些报道。Hamano等[18]认为鼻黏膜切片组织中1型组胺受体mRNA的表达在变应性鼻炎中明显高过非变应性鼻炎，而体外培养的鼻黏膜上皮细胞中1型组胺受体mRNA表达也在变应性鼻炎中明显高过非变应性鼻炎，但是体外培养的鼻黏膜血管内皮中1型组胺受体mRNA表达在变应性鼻炎与非变应性鼻炎组之间差异无统计学意义，另外鼻黏膜上皮细胞与血管内皮细胞中都没有2型组胺受体mRNA的表达。这些研究似乎说明在变应性鼻炎中起主要作用的是1型组胺受体。然而Hirata等[19]的研究则认为鼻黏膜切片组织中有2型组胺受体的表达在变应性鼻炎中明显高过非变应性鼻炎，而组织原位杂交(tissue in situ hybridization) 分析中2型组胺受体mRNA表达也是在变应性鼻炎中明显高过非变应性鼻炎，而其主要分布于下鼻甲黏膜中的上皮层的浆液细胞及黏液细胞中。目前有关于成纤维细胞中1型与2型组胺受体的各种研究[ 16，17]，但是鼻黏膜成纤维细胞中的研究及变应性鼻炎组中的研究罕有报道，更没有3型与4型组胺受体的报道，而本次实验中也没有发现3型与4型组胺受体mRNA的表达(图2)，所以我们考虑作用于鼻黏膜成纤维细胞的组胺的作用可能是通过1型与2型组胺受体作用于鼻黏膜。本次研究中在没有刺激的情况下，1型与2型组胺受体mRNA表达只有在培养24 h的时候变应性鼻炎组中有显著性差异，而总体上变应性鼻炎组中的表达高于慢性单纯性鼻炎组中的表达(表2)。这些启示我们鼻黏膜成纤维细胞组胺受体也可能参与变应性鼻炎的病理生理过程。根据島田均等[20]的研究，变应性鼻炎患者中组胺反应亢进的花粉飞散期里，鼻黏膜中1型组胺受体的数量不但没有增多反而减少，认为单靠组胺受体的数量与亲和性的变化难以说明组胺反应性变化。Zenmyo等[21]在类风湿性关节炎患者关节滑膜的成纤维细胞中证明了1型组胺受体的存在，并认为组胺可以使1型组胺受体的表达增多。本次研究中组胺的刺激并没有使鼻黏膜成纤维细胞的1型与2型组胺受体mRNA表达在变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎鼻黏膜成纤维细胞出现显著性差异，也就是体外培养成纤维细胞的时候低浓度的组胺的刺激对1型与2型组胺受体mRNA在鼻黏膜成纤维细胞中的表达未能够起到足够的作用(表3)。这些提示我们限定在一定浓度内的组胺的刺激对鼻黏膜成纤维细胞中的1型与2型组胺受体mRNA起不了上向或下向调节作用。Vannier等[22]说明了用组胺通过2型组胺受体刺激末梢血液的单核细胞时组胺浓度的重要性，强调了作为刺激物组胺的适当的浓度，认为单靠组胺一种对IL-1β蛋白质的合成中起不了作用，认为只有与IL-1α或与其他的细胞因子混合刺激的时候才引起有效的反应。本次的实验也许用各种不同的细胞因子共同刺激的时候可能更加全面的了解成纤维细胞的其他特性。在诸多的炎性细胞因子中IL-1β与TNF-α参与呼吸道的炎症反应，引起炎性反应的变化，尤其是特征性地存在于哮喘中[23～25]。也有研究表明以哮喘为主要症状的气道洗涤液中IL-1β与TNF-α明显的增多[26]。这些都说明IL-1β与TNF-α在变应性鼻炎与哮喘中起着重要的作用。为了使培养的成纤维细胞处于更接近变应性鼻炎的微环境，本次研究中我们也选择了IL-1β与TNF-α作为刺激物，了解鼻黏膜成纤维细胞中组胺受体表达的特性。用IL-1β(10 ng/ml)刺激情况下1型组胺受体的mRNA在变应性鼻炎组中明显比慢性单纯性鼻炎组表达得低，刺激12 h(P=0.047)，24 h(P=0.009)，48 h(P=0.000)，见表3。而且在慢性单纯性鼻炎组中刺激12 h的时候比未开始刺激的时候表达明显增多。这些结果说明IL-1β刺激变应性鼻炎组的时候从刺激初期开始减少1型组胺受体的mRNA表达，并且其作用持续较长的时间，而慢性单纯性鼻炎组中则从刺激初期开始增加1型组胺受体的mRNA 表达。也就是变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组表现出相反的反应。Krouwels等[27]认为除了一部分1型组胺受体起到免疫功能诱导或炎症反应的向上调节作用外，2型组胺受体则抑制免疫细胞或炎症细胞的功能。我们认为在变应性鼻炎反应中通过1型组胺受体可以诱导免疫反应或炎性反应引起变应性鼻炎的症状，另外过敏反应中增加的IL-1β等炎性细胞因子的刺激可能抑制变应性鼻炎鼻黏膜1型组胺受体的表达方式来阻止变应性鼻炎症状无限期延迟的趋势。IL-1β的刺激下2型组胺受体mRNA的表达在变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组并没有表达程度上的差异，在变应性鼻炎组中与没有刺激的时候表达增多的趋势相比有刺激条件下却出现2型组胺受体mRNA表达却呈现逐渐减少的趋势。我们估计在过敏性反应中在IL-1β的刺激下相比，1型组胺受体能够迅速抑制症状情况相比，而2型组胺受体则以缓慢减少的方式来削弱免疫反应与炎性反应。其他的研究者指出被抗原致敏的小鼠模型中用IL-1β受体的拮抗剂可抑制呼吸道的过敏反应与炎性细胞的浸润[26]。也就是说明，IL-1β在变应性鼻炎的反应过程中起着复杂的作用，既可促进过敏反应及炎性反应，也可以通过对成纤维细胞的组胺受体刺激可以抑制这些过敏反应或炎症反应，所以在鼻黏膜功能中除了成纤维细胞之外，对其他细胞的相互作用也必须考虑在一起。TNF-α刺激下1型组胺受体mRNA的表达在变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组中并无显著性差异，而且在变应性鼻炎组与慢性单纯性鼻炎组用TNF-α刺激前与刺激后也未出现显著性差异。也就是在这次的实验中TNF-α的刺激对1型组胺受体mRNA的表达不产生影响，然而2型组胺受体mRNA的表达在变应性鼻炎组刺激48 h后变应性鼻炎组比慢性单纯性鼻炎组显著增多(表5)。在变应性鼻炎微环境条件下IL-1β与TNF-α等对2型组胺受体mRNA的表达可能起到调节作用，但是具体的临床意义需要进一步的研究。在本次研究中只有一种浓度的IL-1β(10 ng/ml)，TNF-α(10 ng/ml)，组胺(10-7M)刺激成纤维细胞后研究了1型与2型组胺受体mRNA的表达情况。Kohka等[28]在用组胺刺激PBMCs后生成细胞因子的研究中观察到，组胺在只有适当浓度的条件下，PBMCs才可以促进或抑制产生各种细胞因子。本次研究中我们只选用一种浓度的刺激物，所以还无法全面地把握变应性鼻炎与慢性单纯性鼻炎成纤维细胞的所有特性。受体mRNA的表达可能起到调节作用，但是具体的临床意义需要进一步的研究。(本文图1见封三)
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