MTT比色法检测苦杏仁甙对兔晶状体上皮细胞增生的影响

【摘要】  目的 研究苦杏仁甙(Amygdalin)对体外培养的兔晶状体上皮细胞增生的影响。方法 取第2代对数生长期的兔晶状体上皮细胞，培养24h后，加入不同浓度的苦杏仁甙(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125mg/L)作用24h后，采用MTT法观察苦杏仁甙对兔晶状体上皮细胞增生的影响。结果 苦杏仁甙随着浓度的增加，兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用逐渐增强。结论 苦杏仁甙能有效抑制体外培养的兔晶状体上皮细胞增生，其抑制作用在一定浓度范围内有剂量依赖性。

【关键词】  苦杏仁甙;兔晶状体上皮细胞;后囊浑浊;MTT比色法

The effects of Amygdalin on proliferation of lens epithelial cells in vitro

　　ZHOU Fan，ZENG Xianli，PENG Min.Eye Center of Wangwang Hospital in Hunan,Changsha 410016,China

　　 Objective To study the effects of Amygdalin on the proliferation of rabbit lens epithelial cells(RLECs)in vitro.Methods RLECs were primary cultured.After the second generation of RLECs were incubated for 24 hours，we added different concentraions of Amygdalin for 24 hours.The cell proliferation of RLECs was determined by MTT assay.Results The inhibitory rates of RLECs proliferation were increased in dose.dependent ways by Amygdalin in vitro.Conclusion Amygdalin could effectively inhibit the proliferation of RLECs，and it might have broad prospects in the prevention of posterior capsular opacification.

　　[Key words] amygdalin;rabbit lens epithelial cells;posterior apsular opacification;MTT assay

　　后囊浑浊(posterior capsular opacification，PCO)是现代白内障囊外摘出人工晶状体植入术后最常见的并发症。后囊混浊的发生主要由于术后残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial　cells，LECs)发生增生及后囊的纤维化有关。其发生率往往与年龄相关，年龄越轻，发生率越高。在成人，术后发生率为30%～50%，在儿童则为100%。因此，如何有效地抑制晶状体上皮细胞增生对于PCO的防治具有重要意义。苦杏仁甙(Amygdalin)是中药桃仁的主要成分，是一种能生氰(cyanogensic)的化合物。存在于水果果核和坚果中。有研究表明它能有效抑制纤维母细胞增生[1]，而且可以明显地抑制组织的纤维化[2]。这里我们采用MTT比色法研究其对体外培养的兔晶状体上皮细胞(rabbit lens epithelial cells，RLECs)增生的影响，为进一步探索其作用机制提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 试剂与仪器 主要试剂苦参碱购自西安天丰生物科技有限公司;胰蛋白酶、小牛血清、DMEM干粉培养基、噻唑蓝、二甲基亚砜。二氧化碳培养箱、倒置相差显微镜、超净工作台、自动酶标读数仪(E2500型，美国BioRad)。

　　1.2 细胞培养方法 健康雄性新西兰大白兔5只，体重1.4～1.6kg，以空气栓塞法处死。立即取出眼球置于1∶8000的庆大霉素生理盐水中，无菌手术台上将其晶状体取出。在手术显微镜下，剥离晶状体囊膜，剪为大小约1mm2的小块，均匀平贴于培养皿中，间隔3～5mm。放置2～3h待囊贴牢后后，加入含20%小牛血清的DMEM培养基至刚好浸没囊膜，置入二氧化碳培养箱培养。3～5天换液1次，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化。按1∶2的比例接种到培养瓶中。倒置显微镜下动态观察细胞生长情况，取第2代细胞进行实验。

　　1.3 细胞处理 取第2代RLECs，用胰酶消化并调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔200μl。置入二氧化碳培养箱，培养24h静待细胞贴壁;加入1g/L苦杏仁甙PBS溶液并调整浓度为4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125mg/L，空白对照组则加入等量的PBS溶液，培养24h后，每孔加入MTT(5mg/L)溶液20μl，继续培养4h后中止培养，吸去孔内培养上清液，加入150μl二甲基亚砜溶液，室温下微量振荡器振荡10min，自动酶标仪比色(波长570nm)，测定吸光值。以此计算细胞存活率和细胞抑制率(细胞存活率%=药物组平均吸光度值/正常对照组平均吸光度值×100%，细胞抑制率%=100%-细胞存活率)。

　　1.4 统计学分析 本研究获取的数据采用(±s)表示，用SPSS13.0进行成组资料的方差分析进行统计学分析，对检验显著性水准为α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度的苦杏仁甙溶液对RLECs增殖的影响 见表1。表1 不同浓度的苦杏仁甙溶液对RLECs增殖的影响注：经统计学处理，对照组与各试验组比较差异有显著性(P<0.05);各浓度组组间比较差异有显著性(P<0.05)

　　2.2 不同浓度的苦杏仁甙溶液对RLECs增殖的影响 见图1。我们MTT比色法检测显示，苦杏仁甙对体外培养的兔晶状体上皮细胞增生有抑制作用(表1、图1)，在同样处理24h的时间段内，细胞的存活率随苦杏仁甙浓度梯度的上升呈逐渐下降的趋势，其对细胞增殖的抑制能力也逐步增强。

　　图1 不同浓度苦杏仁甙溶液对RLECS增殖的影响

　　3 讨论

　　目前，对于晶状体手术后晶状体后囊浑浊的抑制研究已经非常深入。其发生机制与手术刺激、残存的晶状体上皮细胞的特性、眼房水屏障的破坏及多种细胞因子的作用等有关。人们有针对性地对后囊混浊的特点进行多种思路的抑制研究，应用抗代谢药物，如5FU、秋水仙碱、甲氨蝶呤、柔红霉素、丝裂霉素等。这些药物的毒副作用较大，对眼内组织的影响较大，目前还没有较好的解决方案，限制其临床应用。

　　苦杏仁甙属于芳香族氰甙，存在于多种植物的种子中，其抗肿瘤、抗纤维化及抗氧化作用已经得到多方的证实，有研究表明，它可以有效抑制人胎肾成纤维细胞的增殖，并可以诱导其凋亡[3]。我国洪长福等研究证实其能有效地延缓肺纤维化的形成[4]。我们的实验结果证实苦杏仁甙对晶状体上皮细胞的增生有明显的抑制作用，并具有良好的剂量依赖性，对晶状体上细胞的抑制效果相当的明显。苦杏仁甙分子结构含有两个分子的葡萄糖，一个分子的氰氢酸和一分子的苯甲醛。在体内苦杏仁甙被β糖苷酶(Glucosidase)作用分解成其组成成分，释放出氰化物而发挥其抑制作用，氰化物本身具有很强的细胞毒性，能抑制线粒体的功能，使细胞窒息死亡，因此，作用较强。由于体内还有种酶叫硫氰酸酶(rhodanase)。硫氰酸酶可以将游离的氰化物变成无毒的硫氰酸化合物，其应用有较高的安全性。因此，我们认为苦杏仁甙在防治后囊浑浊方面具有一定的应用前景。但其安全使用的方法是浸泡即将植入的人工晶体还是按一定比例加入白内障手术的灌注液中，仍需进一步研究。

【参考文献】
  　1 宋月莲，郑应昭，李素慧.中药桃仁对体外纤维母细胞增生的抑制作用的实验研究.中西医结合眼科杂志，1995,1：13.

　　2 郭君其，盛明雄，谭建明，等.苦杏仁甙抑制大鼠肾脏纤维化的实验研究.实用医学杂志，2007，23(17)：26282630.

　　3 屈燧林，方勤，陈高翔，等.汉防己甲素、川芎嗪和苦杏仁甙对人肾成纤维细胞的影响.中华肾脏病杂志，2000，16(3)：1820.

　　4 洪长福，娄金平，周华仕，等.桃仁提取物对大鼠实验性矽肺纤维化的影响.浙江省医学科学院学报，2000，11(1)：711.