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【摘要】 目的 观察汉防己甲素对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells , HUVEC)中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor , VEGF)mRNA 和血管内皮生长因子受体-2(Fetal liver kinase， Flk1)蛋白表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法 应用MTT法测定不同浓度(10-3、10-4、10-5、10-6M)Tet对HUVEC的抑制作用，用免疫组织化学和原位杂交方法分别检测血管内皮生长因子受体-2(Flk1)蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA在血管内皮细胞中的表达。结果 (1)Tet能抑制HUVEC增殖且具有量效依赖关系;(2)Flk1蛋白、VEGF mRNA在1640对照组、Tet实验组中的表达率分别为(0.742±0.057， 0.445±0.066)，(0.596±0.047， 0.324±0.049)。Tet明显降低Flk1蛋白、VEGF mRNA在内皮细胞中的表达(P<0.05)。结论 汉防己甲素下调人脐静脉内皮细胞中VEGF mRNA和Flk1蛋白的表达，从而抑制人脐静脉内皮细胞增殖。
【关键词】 汉防己甲素;人脐静脉内皮细胞;血管内皮生长因子受体;血管内皮生长因子
Flk1 protein and VEGF mRNA in tetrandrine on human umbilical vein endothelial cells
LI Dai,LI Qing-chun.Department of Ophthalmology,Xianning College, Xianning 437100,China
Objective To investigate the inhibitory effect of tetrandrine (Tet) on the VEGF mRNA and Flk1 in the third passage human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) in vitro and discuss the drug effects of Tetrandrine in anti-angiogenesis.Methods Cultured HUVEC were exposed to different concentrations of Tet solution(10-3、10-4、10-5、10-6M) and investigated by MTT assay. Using immunochemistry to observe the expression of Flk1 and VEGF mRNA was examined by utlizing in situ hybridization (ISH) in cultured HUVEC.Results (1)Tet (10-3、10-4、10-5、10-6M) significantly suppressed the proliferation of HUVEC in vitro and showed a dose-dpendent tendency. (2)The rate of the expression of Flk1 and VEGF mRNA in Tet-treated group was 0.445±0.066， 0.324±0.049, respectively and that in control group was 0.742±0.057, 0.596±0.047，respectively.Conclusion Tetrandrine at some concentrations can suppress the expression of Flk1 and VEGF mRNA in cultured HUVEC, and inhibit HUVEC's proliferative activity. Tetrandrine is a potent antiangiogenic agent.
[Key words] Tetrandrine; human umbilical vein endothelial cell; Flk1; VEGF
眼部新生血管是许多种眼科疾病的常见并发症之一,常导致视力减退或盲，而血管内皮细胞生长因子(VEGF)在血管生成过程中起着重要作用[1],因此近年来,新生血管研究的体外实验大多都集中在防治血管内皮细胞生长因子和其特异性受体的相关研究上。汉防己甲素(Tetrandrine,Tet)是中药粉防己的有效单体成分, 我们的实验已经证实，Tet具有抑制人脐静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cell，HUVEC)增生的作用[2]，本实验进一步观察Tet对HUVEC中血管内皮生长因子(VEGF)mRNA 和血管内皮生长因子受体-2(Flk1)蛋白表达的影响，为探讨其作为抗眼部新生血管形成药物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验仪器 CO2培养箱、超净工作台、高速离心机、酶标仪 (DG3022A型)、倒置相差显微镜。
1.2 主要试剂 Tet(同济医科大学提供)、碘化丙啶、MTT、RPMI 1640 小牛血清 RNase 0.25%胰蛋白酶，EDTA Hanks液(同济医科大学免疫教研室提供);兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体、鼠抗人Flk1——受体单克隆抗体(中山试剂公司提供)。VEGF原位杂交试剂盒(博士德试剂公司)、SABC试剂盒，DAB显色试剂盒(中山试剂公司提供)。
1.3 HUVEC的培养
1.3.1 原代内皮细胞的培养 无菌条件下,取分娩新鲜胎儿脐带(不少于20cm)。按文献[3]方法,培养液为1640培养液(内含20%小牛血清,青霉素100μg/ml，链霉素100μg/ml， L-谷氨酰胺2mmol/L)，置37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养, 2～3天换液1次。
1.3.2 传代内皮细胞的培养 原代内皮细胞融合后用培养液冲洗2次,然后用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA1：1充分混匀后,加入到内皮细胞中,边消化边在倒置显微镜下观察,细胞皱缩,彼此分离或呈大片状分离即可用20%小牛血清培养液终止消化。吸管吹打成细胞悬液,计数后按105个细胞/ml继续培养。
1.4 HUVEC的鉴定[2] 用倒置相差显微镜,每天观察细胞形态和生长情况。用SABC法进行Ⅷ因子相关抗原检测,进行细胞鉴定。
1.5 MTT法检测HUVEC的增生活性[2] 第三代HUVEC细胞，调整细胞浓度为105个/ml，转移到96孔板内，置37℃，5%CO2培养箱中培养24h后，弃去原培养液加10-3、10-4、10-5、10-6M的Tet培养液200μl。每6个孔为一级浓度，无药培养液为对照组，共5组，5%CO2，37℃培养24h后弃去接种液每孔加入浓度为5mg/ml，20μl MTT溶液，继续培养4h后，弃原有培养液，每孔加入DMSO 200μl，震荡15min，摇匀后DG-3022A型酶联免疫检测仪检测各孔OD值(检测波长=570nm)，并以下列公式计算细胞抑制率:细胞抑制率=(空白对照组平均OD值-处理组平均OD值)/空白对照组平均OD值×100%。
1.6 用原位杂交技术检测Tet对HUVEC中VEGF mRNA表达的影响 取第三代体外培养的HUVEC，以105个/ml的密度将细胞接种于含有盖玻片的12孔板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养4、5天后取出爬满细胞的玻片，用含0.01%DEPC的4%多聚甲醛(0.1M PBS)室温固定45min，DEPC水充分洗涤，干燥后-20℃保存备用。按照原位杂交检测试剂盒提供的方法进行，DAB显色，梯度酒精脱水，中性树胶封片。以HUVEC胞浆呈棕黄色为阳性。
1.7 用免疫组织化学法分析Tet对HUVEC中Flk1表达的影响 以105个/ml的密度将细胞接种于预先放置9mm×18mm盖玻片的12孔板中置37℃，5%CO2的培养箱中培养，每孔0.5ml培养24h后，用无血清培养液静息24h，将浓度为10-5M的Tet培养液加入培养孔中，对照组加1640培养液，置24h后停止培养，取出盖玻片，用PBS洗3次，每次2min，冷丙酮固定30min，PBS冲洗每次2min，干燥后可冷冻保存。采用SABC法：一抗为1：50的小鼠抗人Flk1抗体，二抗为1：100稀释的羊抗小鼠生物素抗体。阴性对照为用PBS代替一抗二抗，阳性对照为乳腺癌标本。
1.8 统计学处理 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统对细胞片进行图像分析，所有细胞片均统一放大(×100)，在同一强度下随机选取5个视野观察分析光密度值(Dλ)值，数据均以平均值±标准差(±s)表示，均数间比较用t检验，统计均用SPSS 11.0 软件处理。
2 结果
2.1 人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定[2] 用胰蛋白酶消化的HUVEC接种在24孔塑料培养板各孔内4h后,大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、团状,少数细胞伸展, 48～72h生长最快,逐渐生长成梭形,有些细胞排列呈鱼贯状相连,间有旋涡状排列。核呈圆形或椭圆形,分裂相多见, 1～2个核仁,胞浆丰富,内含小颗粒。3～4天后融合, 7～10天胞体呈多角形,相互嵌合,为单层铺路石状(图1)。SABC法Ⅷ因子鉴定血管内皮细胞:内皮细胞浆内呈棕黄色沉淀,以核周最为明显,细胞界限清楚(图2)。
2.2 MTT试验检测HUVEC细胞增生活性[2] 不同浓度Tet作用下的HUVEC的MTT检测结果显示:加入Tet之后的OD值与未加入Tet时比较均明显降低(P<0.01)，且随着药物浓度升高,OD值逐渐降低,抑制率逐渐升高,呈现出剂量依赖关系(表1)。cP<0.01vs0 concentration group IC50: 9.43×10-6。表1 Tet对HUVEC增生活性的影响
2.3 Tet对HUVEC中VEGF mRNA表达的影响 显微镜下观察内皮细胞中的VEGF mRNA表达阳性部位呈棕黄色，以胞浆为主(如图3，4)，图像分析系统测得的平均光密度结果表明：Tet实验组光密度值(0.324±0.049)明显低于对照组( 0.596±0.047 )，P<0.01。Tet能明显抑制VEGF mRNA的表达，见表2。
2.4 Tet对HUVEC中Flk1表达的影响 显微镜下观察内皮细胞中的Flk1表达阳性部位呈棕黄色，以胞膜为主(如图5，6)，图像分析系统测得的平均光密度结果表明：Tet实验组光密度值(0.445±0.066)明显低于对照组(0.742±0.057)，P<0.01。Tet能明显抑制Flk1的表达，见表2。表2 10-5Tet对HUVEC中VEGF mRNA、Flk1表达的影响
3 讨论
新生血管形成与眼部各组织病变的病理生理过程密切相关，而笔者实验中选用的人脐静脉内皮细胞是进行新生血管研究中最常用、最理想的工具[4]。内皮细胞在成年器官中的更新极慢,通常处于静息态,一旦受到缺血、缺氧、炎症等刺激,则使内皮细胞由静息态转变成激活态,重新进入细胞周期,开始增生。
随着分子生物学的不断发展，人们已经纯化出40余种与血管生成有关的细胞因子，各种细胞因子和生长因子分别作用于血管内皮细胞上的受体发挥作用。也正是由于这些和谐、平衡的调控失调，导致内皮细胞激活，各种生长因子分泌增加，在上述生长因子当中，VEGF是最重要的血管生长因子之一，VEGF可在很多正常人和动物组织中表达，但量较低，在病理条件下，VEGF无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均有过量的表达。VEGF表达的调节机制目前还不是很清楚，但一些研究显示某些细胞因子如TGF-β、膜联蛋白A2等都对VEGF的表达有上调作用[5，6]。VEGF通过与其受体结合而发挥生物学效应，目前已在血管内皮细胞细胞膜上检出两种具有与VEGF高度特异性结合的受体flt-1(fms-like tyrosine kinase)和flk-1(fetal liver kinase 亦称KDR),同属Ⅲ类酪氨酸激酶受体。VEGF受体仅存于血管内皮细胞中，正常情况下表达水平甚低，大多数组织中不予检出。但病理条件下，可在其附近的血管内皮细胞中检测到这两种受体的高度表达。虽然flt-1和 flk-1都能与VEGF高度亲和，但作用似有分工：flt-1主要是通过核因子-κB和凋亡蛋白抑制剂-1通道来抑制血管平滑肌细胞的凋亡，进而增进新生血管的形成[7];而flk-1的功能是以增进血管内皮细胞的成熟为主，并促进造血祖细胞的快速分化[8]。Shinkaruk S等[9]对多项VEGF及其受体间相互作用的研究数据整理发现：flk-1无论是在生理性还是病理性血管形成过程中都是起着主要作用的，且VEGF-flk1信号通路也是抗血管形成药物和促血管形成药物研究的首选靶点。如己酮可可碱、木蝴蝶素甲、人参皂苷等都是通过影响flk-1来减少新生血管形成的[10～12]。
本实验结果不仅证实了有活性的内皮细胞可以表达VEGF mRNA和Flk1蛋白,还可推测VEGF对内皮细胞增殖影响至少存在自分泌这一途径。而且提示Tet还可通过抑制VEGF mRNA和Flk1蛋白表达来阻止上述自分泌途径，达到抑制内皮细胞增殖、迁移等功效。同时进一步预示Tet可能成为一种有效的新生血管抑制剂,为眼部新生血管等的防治提供了新的思路。
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