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【摘要】 目的 研究还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧（A/R）损伤的影响。 方法 建立心肌细胞A/R损伤模型，随机分为5组:A组，正常对照组;B组，单纯缺氧/复氧（A/R低氧2h，复氧1h）组;C、D、E组为还原型谷胱甘肽处理组，加入还原型谷胱甘肽（GSH）分别使其终浓度为40、80、160mg/L，后A/R。于复氧后测定各组培养液中乳酸脱氢酶（LDH）变化及细胞内丙二醛（MDA）含量和细胞存活率。 结果 与正常组相比，单纯低氧/复氧组LDH漏出量、MDA水平显著升高（P<0.01），细胞存活率显著降低（P<0.01）。与缺氧/复氧组比较，各谷胱甘肽处理组上述变化明显减轻（P<0.05）。 结论 还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞A/R损伤具有保护作用，并具有浓度依赖性。
关键词 还原型谷胱甘肽 心肌细胞 缺氧 复氧
The effects of reduced glutathione sodium on anoxia/reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes
Wang Jin，Wang Yibiao，Yang Haiying，et al.
The Second Affiliated Hospital of Shandong University of TCM，Jinan250001.
【Abstract】 Objective To study the effects of reduced glutathione sodium（GSH）on anoxia/reoxygenation in-juries of neonatal rat cardiomyocytes.Methods A/R model of myocardial cells of neonatal rats was established.The cells of neonatal rats were randomly divided into five groups:control group（A）:without any treatment;A/R group（B）:2-hour anoxia followed by1-hour reoxygenation;GSH conditioned group（C）:adding GSH into culture medium till the final concentration of40mg/L then A/R;GSH conditioned group（D）:adding GSH into culture medium till the final concentration of80mg/L then A/R;GSH conditioned group（E）:adding GSH into culture medium till the final concen-tration of160mg/L then A/R.The activity of lactate dehydrogenase（LDH），the contents of cellular melondadehyde（MDA）and the rate of cell viability of each group were evaluated after reoxyenation.Results Compared with group A，the A/R group showed a great increase in levels of LDH，MDA and a decrease in the rate of cell viability（P<0.01）.Compared with group B，the GSH conditioned groups significantly attenuated these changes（P<0.05）.Conclusion GSH could be a protective effect on A/R injury of neonatal rat cardiomyocytes in a concentration dependent manner.
Key words reduced glutathione sodium cardiomyocytes anoxia reoxygenation
心肌缺血/再灌注损伤是临床上多种疾患中常见的一种病理损害;心肌细胞的缺氧/复氧是其主要的病理基础，以往实验证实，缺氧/复氧损伤与缺血再灌注损伤的实质有非常类似之处，引起再灌注损伤的主要因素目前认为与钙离子超载 ［1，2］ 、氧自由基 ［3］ 和白细胞聚集有关，本实验通过在细胞水平模拟心肌缺血再灌注损伤，用不同浓度还原型谷胱甘肽（GSH）处理心肌细胞以了解作为一种氧自由基清除剂，还原型谷胱甘肽对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 实验用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山东大学实验动物中心提供，雌雄不拘;DMEM培养基由爱博公司出品;胎牛血清为美国Gibco公司出品;胰酶为Sigma公司出品;丙二醛（MDA），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购自南京建成生物研究所;还原型谷胱甘肽（古拉定）由Laboratorio Farmaceutico C.T.S.R.1生产（批号:4027）。
1.2 乳鼠心肌细胞培养 无菌取出生1～3天大鼠乳鼠心脏，剪碎后用0.25%胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15%胎牛血清的高糖DMEM中止消化，离心取心肌细胞沉淀，加入培养液，集中混匀制成悬液，应用差速贴壁法分离纯化心肌细胞，以5×10 5 /ml的培养密度接种于24孔培养板中，在CO 2 培养箱中培养，48h后换液。
1.3 实验分组及操作程序 试验分为5组，每组重复8孔，A组为正常对照组（培养板置培养箱中持续孵育3h结束实验）;B组为单纯缺氧/复氧组（A/R缺氧2h，复氧1h）:将培养板置于充有99.5%氮气的缺氧孵育器中37℃密闭培养2h，再以95%氧气+5%二氧化碳进行复氧1h;C组，D组，E组为古拉定处理组，加入古拉定使其终浓度分别为40、80、160mg/L。各组缺氧前、复氧前均给药。
1.4 实验检测指标 （1）计数细胞搏动:在倒置显微镜观察并计数心肌细胞搏动的频率及节律。（2）细胞存活率计数:采用台盼蓝排斥法检测，各组取少许细胞混悬液，0.4%台盼蓝混匀2min，按白细胞计数法在光镜下计数蓝染细胞。台盼蓝摄取率=蓝染细胞/（蓝染细胞+未蓝染细胞）×100%。（3）LDH及MDA活性及含量测定:实验结束后按试剂盒说明测定。
1.5 统计学方法 数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，采用SPSS10.0统计软件进行one-way ANOVA统计学处理，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 古拉定对缺氧/复氧心肌细胞搏动的影响 正常培养对照组心肌细胞搏动相对恒定，节律规则;A/R组心肌细胞搏动频率减慢，搏动幅度减弱，节律不齐，有部分停搏，与对照组相比，差异有非常显著性（P<0.01）;各古拉定处理组明显逆转A/R损伤造成的搏动频率和节律异常，与A/R组比较差异有显著性（P<0.05）。
2.2 古拉定对心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响 结果表明，A/R心肌损伤是十分明显的，而古拉定能明显减轻这种损伤，古拉定处理组各观察指标均差异有显著性，因此提示古拉定对于缺氧/复氧心肌细胞损害具有保护作用，且存在量效关系，见表1。
表1 还原型谷胱甘肽对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤LDH及MDA的影响 （略）
注:B组与A组比较，P<0.01;与B组比较， ** P<0.01;与B组比较， * P<0.05
3 讨论
3.1 还原型谷胱甘肽对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响 大量研究表明，缺血再灌注期间大量氧自由基的产生可造成细胞损伤。氧自由基导致细胞损伤主要环节为作用于细胞外基质，使胶原和透明质酸崩解，使膜磷脂结构的多聚不饱和脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜;肌浆网和线粒体崩溃，心肌细胞在缺氧缺糖条件下，ATP产生减少，代谢障碍，代谢产物堆积，使膜稳定性降低，溶酶体释放，导致生物损伤、变性，使LDH释放在培养基中，同时再给氧时氧自由基增加，细胞膜受攻击，细胞膜损伤。细胞内LDH进一步增加，故LDH释放量是观测缺血再灌注损伤重要指标。脂质过氧化产物丙二醛（MDA），其含量变化可作为评定自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标。本实验从培养的未成熟鼠心肌细胞入手，排除了在体和离体灌注模型中神经、体液因素及其他混杂细胞因素的影响，直接利用还原型谷胱甘肽处理培养的未成熟鼠心肌细胞，结果发现还原型谷胱甘肽各浓度组均可降低缺氧/复氧损伤造成的心肌细胞死亡率，减少细胞内LDH漏出，减少细胞内MDA生成，且存在量效关系，表明还原型谷胱甘肽对未成熟鼠心肌细胞有保护作用。
3.2 还原型谷胱甘肽对缺氧/复氧心肌细胞损伤的保护机制 还原型谷胱甘肽（GSH）对清除自由基有重要作用，它是机体内一种重要的抗氧化剂，它能有效清除氧化产生的自由基，维持细胞内环境的稳定，并在使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害方面起重要作用 ［4］ 。GSH在谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的作用下对有机过氧化物（ROOH）和无机过氧化物（H 2 O 2 ）起重要清除作用，其还可以起维生素C还原剂的作用，使维生素C成为还原型而不断清除超氧自由基。近期有研究表明 ［5］ ，GSH可维持线粒体内膜巯基基团的还原状态。当GSH含量下降，内源性自由基攻击线粒体蛋白巯基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影响线粒体氧化代谢的3个关键酶及电子传递链中酶的活性，NADH减少，ATP产生减少。另一方面，导致膜蛋白巯基氧化交联，构型改变，线粒体膜渗透性转运通道打开，钙释放增加，胞浆钙上升，激活细胞膜PLA2和中性蛋白水解酶（CANP），导致细胞膜的损伤或死亡。本实验表明补充外源性GSH，对保护细胞膜的功能可能具有重要意义，对临床各种疾患造成的心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用。
参考文献
1 Shigematsu S，Arita M.Anoxia depresses sodium-calcium exchange cur-rents in guinea-pig ventricular myocytes.Mol Cell Cardiol，1999，31（4）:895-906.
2 Schafer C，Ladilov YV，Schafer M，et al.Inhibition of NHE protects reox-genated cardiomyocytes independently of anoxic Ca 2+ overload and acido-sis.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，33（2）:343-357.
3 Salie R，Harper I，Cillie C，et al.Melatonin protects against ischaemic-reperfusion myocardial damage.J Mol Cell Cardiol，2001，33（2）:343-357.
4 Changce B，Sies H，Boveris A.Hydroperoxide metabolism in mammalian organs.Physiol Rev，1997，59（3）:527-605.
5 Alession HM.Lipid peroxidaton and scavengerenzymes during exrcise:adoptive response to training.Physiol，1998，64:133-1336.
（编辑夏 露）
作者单位:250001山东济南山东中医药大学第二附属医院
250033山东济南山东大学第二医院儿科