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肌萎缩症年会报告——2006年6月13~16日——儿童杜氏肌萎缩症治疗进展

来源:中华现代儿科学杂志
摘要:肌萎缩症年会报告——2006年6月13~16日——儿童杜氏肌萎缩症治疗进展(pdf)2006年6月13~16日,肌萎缩计划(theParentProjectMuscularDystrophy,PPMD)年会在美国俄亥俄州辛辛那提举行,会议的主题是:Faceit。首先,全体专家回顾了杜氏肌萎缩症的研究成果及其治疗的各类方法(Faceit。在报告的起始部分,介绍了理......

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    肌萎缩症年会报告——2006年6月13~16日——儿童杜氏肌萎缩症治疗进展 (pdf)

    2006年6月13~16日,肌萎缩计划(the Parent Project Muscular Dystrophy,PPMD)年会在美国俄亥俄州辛辛那提举行,会议的主题是:Face it!Live it!Change it!36位肌肉疾病研究领域的科学家和临床专家出席了会议。首先,全体专家回顾了杜氏肌萎缩症的研究成果及其治疗的各类方法(Face it!)。然后,提出了针对患病儿童的不同治疗方案(Live it!)。最后结果显示,专家们的最新研究成果已经非常接近找到一种有效的治疗方法(Change it!)。德国生物化学家Günter Scheuerbrandt,PhD,受会议创办人和本次会议主席Patricia Furlong委托,撰写了这篇报告。在报告的起始部分,介绍了理解儿童杜氏肌萎缩症的基础知识,包括4个方面:基因如何制造蛋白质、dystrophin的重要性、当前的主要研究方法、外显子越过的作用方式。美国宾夕法尼亚州立大学的Lee Sweeney、英国伦敦皇家学院的Dominic Wells、西澳大利亚大学的Steve Wilton,分别在会议上详细报告了这4个方面的问题。

    1基因如何制造蛋白质

    基因是遗传物质脱氧核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的功能单位。双螺旋是基因的结构特征,由四个小分子构成:adenine,guanine,thymine,and cytosine(A,G,T,C)。在空间结构上,一条DNA单链由碱基对A-T和G-C构成。DNA单链上的碱基顺序与另一条上的碱基顺序互补。碱基顺序,即“genetic letters”,是保证生命体发展和延续的遗传信息,代代相传。

    大部分基因携带蛋白质生物合成的指令。基因的遗传指令在细胞核内表达、复制、转录,遗传指令传递到前信使核糖核酸(premRNA),即所谓的转录。大部分基因由活跃区或编码区构成,活跃区即外显子其包含蛋白质复制信息不活跃区内含子作用可能是控制基因活动。转录完成后,内含子从premRNA移出,完成剪接的外显子联结形成mRNA,mRNA移入核糖体,蛋白质结构合成在细胞核外进行。核糖核酸RNAs以碱基U代替DNA中的碱基T。剪接位点是外显子内部和外显子与内含子边缘的特异性序列,是确保非编码内含子序列从前mRNA移出的基本结构。剪接本身由剪接体完成,剪接体是由多种蛋白质和小RNAs构成的复合物。

    在mRNA内,三个连续碱基构成一个密码子,20个氨基酸之一。依据遗传密码,有3个例外。密码子之间没有空隙,密码子转译为蛋白质。在核糖体,mRNA遗传密码被解读、翻译为蛋白质语言,蛋白质由许多,常常是数千个氨基酸组成。上述3个例外即UAA、UAG、UGA为中止密码子,蛋白质合成在UAA、UAG、UGA处停止。

    11Dystrophin基因和蛋白Dystrophin基因突变或损坏导致Duchenne和Becker肌萎缩症,Dystrophin基因携带不同形式Dystrophin蛋白的遗传信息。Dystrophin基因总长2,220,223bp,是已知的最大的人类基因。dystrophin基因的79个外显子中,11,058 bp(05%)决定了骨骼肌中“正常”的dystrophin蛋白的3,685个氨基酸。Dystrophin基因包含7个也可能是8个启动子,不同启动子和变动的剪接形式致使不同形式的dystrophin的存在,它们较肌肉中正常的dystrophin为短。这些dystrophin存在于不同的器官中,它们仅有正常dystrophin 32%长短,其也受突变的影响。这可能是某些杜氏肌萎缩症患儿存在精神问题的原因。

    12Dystrophin基因和蛋白的大小Dystrophin基因双螺旋结构长075 mm。由于遗传物质异常紧密地集结,与其他25,000种人类基因一起,dystrophin基因在细胞核中的直径约001 mm。1分子dystrophin的长度远远短于其基因的长度,为125 nm(=0000125 mm),80,000个dystrophin首尾相接的长度约为1 cm。1 g肌肉中含有1,140亿个dystrophin分子。这充分说明了科学家的任务是多么的艰巨,为了使肌肉恢复功能,意味着使数以亿计的dystrophin恢复正常。

    13Dystrophin的功能Dystrophin是保证肌肉细胞力学稳定性所必需的。Dystrophin存在于肌细胞膜内,dystrophin C-端与细胞膜内其他蛋白质联结,即dystrophinglycoprotein复合物,N-端与肌细胞内的收缩结构相连。Dystrophin的中心部分,即杆状域,由双链氨基酸折返结构形成。肌肉细胞的收缩运动迫使dystrophin蛋白改变长度,折返结构的作用类似弹簧或冲力吸收器。Dystrophin传递肌动蛋白产生的力学能量到肌细胞膜和细胞膜外结缔组织与肌腱,平衡负荷。

    14Dystrophin的其他功能Dystrophin构成dystrophinglycoprotein复合物的复杂结构及许多蛋白质的定位。Dystrophin也可调节细胞内钙浓度和控制肌肉生长。在活细胞中,类似成分的大量精细功能还不是很清楚。

    杜氏肌萎缩症患儿的肌纤维中没有或仅有微量dystrophin。由于dystrophin缺失,肌肉收缩可导致肌细胞膜破裂,大量钙离子外溢至纤维组织。过剩的钙离子激活calpain和其他蛋白酶分解肌蛋白,并且启动细胞凋亡。而后,激活纤维母细胞导致纤维化,形成瘢痕组织,减慢肌肉再生,导致老年杜氏肌萎缩症的典型症状。Becker肌萎缩患儿病程进展缓慢,肌肉内dystrophin含量较正常少,长度也短,肌肉残存部分功能。Andrew Hoe指出,dystrophin缺失不仅影响骨骼肌功能,而且波及平滑肌和心肌。心肌损害造成心肌病。平滑肌损害会产生许多后果,例如:血流增加时,血管舒张功能失常,引起呼吸和其他问题;胃肠运动减少导致胃肠道功能变化。因此,一个基因的改变可以损害人体整体功能。

    15Dystrophin基因突变Dystrophin基因突变分三种类型:(1)缺失,一个或更多外显子缺失;(2)复制,部分基因片断重复;(3)点突变,单个碱基对互换、消失或增加。其他包括倒位和内含子突变,内含子突变改变正常剪接模式。三联体密码子在核糖体中的解读是依次不间断进行的,解读框不能间断,突变可能使密码子的碱基被删除或添加。对于肌萎缩,如果解读尚在框内,还能产生dystrophin,但是比正常长或者短。假如突变没影响dystrophin的基本结构,功能改变仅仅是部分的,疾病形式可能是Becker肌萎缩。然而,假如由一个或两个碱基对突变,使解读框移,解读出框。一些“不正确”的从氨基酸突变位置掺入合成过程,直至新的不成熟的终止编码形成。未合成完的dystrophin无法行使功能,消失,发展为Duchenne肌萎缩。

    2杜氏肌萎缩症治疗策略

    当前,杜氏肌萎缩症治疗研究主要集中在两个方面:两种基因疗法和多种药物干预方法。第一种基因疗法试图向肌细胞核引入新的dystrophin基因,从而促使产dystrophin功能恢复。大量小鼠实验表明,一种修饰过的、“驯服”的病毒——腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV),可以作为载体将dystrophin基因的活性部分——外显子合体——cDNA转运入肌细胞。但是,AAV不足以转运包含全部79个外显子的cDNA,只能转运正常cDNA长度的三分之一,意味着新的dystrophin只有正常大小的三分之一。假如缩短的dystrophin包含某种导致良性Becker肌萎缩症的结构,这种治疗方法就不能治愈杜氏肌萎缩症,只能减慢急进型杜氏肌萎缩症的进程,使其向良性Becker肌萎缩症发展,使患者寿命基本正常。新的遗传物质没有进入染色体,突变的dystrophin基因没有改变,尚存留于X染色体短臂上。第二种基因疗法为外显子跳越技术(exon skipping),也不能改变受损的基因,仅干预遗传信息基因-蛋白质进程。前mRNA的外显子转为mRNA的剪接过程改变,间断的、出框的信息变为可读的框内信息。效果类似基因转移技术,杜氏肌萎缩症向良性Becker肌萎缩症发展。反义寡核苷酸——一种新型的药物——“基因药物”具有上述作用。由于基因疗法研究尚不成熟,从事其研究要保持谨慎的态度。在将基因疗法引入临床实践的进程中不能出现严重失误,以免基因治疗研究出现倒退。因此,推荐的操作规程必须得到严格执行。本次会议讨论的药物疗法将在“药物方法”一节中专门报告。

    3基因疗法

    31外显子越过技术外显子越过技术的目的是使Duchenne突变转变成Becker突变。如果突变干扰解读框,从而导致Duchenne肌萎缩,在缺失、增添突变或点突变前后,从mRNA直接人工移除一个或几个外显子,可以恢复解读框。反义寡核苷酸(antisense oligoribonucleotides,AONs)能够从mRNA删除外显子。AON是短RNA单链结构,由20~30个核苷酸组成,单链只与目标外显子内部、边缘或其他位置的互补序列联结。反义是指AON碱基序列与前mRNA目标外显子序列顺序相反。AON干扰剪接过程,使目标外显子未被包含于mRNA,被越过了或漏掉了。外显子越过不能改变基因自身及其突变,但是其mRNA不再包含被越过的外显子的遗传信息。这种mRNA比正常短,生产的dystrophin蛋白也短,含有氨基酸较少。如果缺失的氨基酸不属于中央杆区等基本区域,短的蛋白也可以起到稳定肌细胞膜的作用。由此,可以使重症Duchenne肌萎缩转变成较轻的Becker肌萎缩。寡核苷酸是DNA和RNA的短片段,“oligo”的意思是“少”。DNA双链的每一条链由磷酸和脱氧核糖单位交替构成。脱氧核糖是五个碳原子组成的糖分子,第二个碳不带氧原子。一个糖单位在其第一个碳原子上携带四种碱基之一。RNA核糖单位的第二个碳原子带氧。核苷酸是DNA和RNA的构成单位。核苷酸由一个核糖、一个碱基、一个磷酸组成。因此,有四种核糖核苷酸和四种脱氧核糖核苷酸。有两种最常用的AON用于外显子越过,是“受保护的”寡核苷酸,肌细胞中的核酸酶缓慢消耗AON。荷兰科学家使用2Omethylphosphothioates,也叫methyl thioates或2Omethyl。2Omethyl有一个甲基团,一个碳带三个氢,第二个碳上的氧带核糖单位,硫原子取代磷酸基团上的氧原子。英国和澳大利亚学者使用morpholinos、dimethyl amide取代磷酸氧,氮携带两个methyl基团,morpholino环取代整个核糖单位,为六员环,每一成员由四个碳原子、一个氧、一个氮原子和氢原子与碳联结。文末附有一个例子,外显子45缺失,越过外显子46恢复解读框(见附录1)。

    311外显子越过(荷兰科学家的首次临床试验)荷兰一个生物技术公司——Prosensa B.V.公司与Leiden大学医学中心的Gertjan van Ommen博士和Judith van Deutekom博士合作,应用外显子越过技术开发治疗Duchenne肌萎缩的药物。Prosensa总裁Gerard Platenburg宣称,2006年5月8日,荷兰CCMO、IRB两委员会批准了题为“应用AON单次肌注恢复dystrophin产出的疗效、安全性、耐受性的探索性研究”的项目。人类外显子越过试验从这里开始。研究对象为6例Duchenne患儿,8~16岁。患者dystrophin基因的突变导致框移,可通过越过外显子51恢复。经过大量临床测试,包括皮肤活检,一种针对外显子51的2Omethyl AON被选出,单次应用与单个胫前肌。药物顺序给予患者,前一个患者未出现副作用,再给予下一个患者。注射后4周,进行肌肉活检,查找缩短的dystrophin蛋白。临床试验的首要目的是证明经过许多临床前肌肉培养实验和动物实验,外显子越过对于Duchenne患者是安全有效的。只要在某个患儿的肌肉中发现了新的dystrophin,即使局部给药不对患儿产生治疗效益,试验也是成功的。荷兰学者选用2Omethylphosphothioate AONs(2Omethyls),因为他们对这种AON在肌组织注射和实验动物全身应用方面有丰富的实践经验。例如,反复经尾静脉注射针对外显子23的2Omethyl,mdx小鼠骨骼肌和心肌都出现有治疗意义的dystrophin。2Omethyls能够进入心肌非常重要,因为其他经过试验的AON,如morpholinos不能进入心脏。而且,萎缩肌肉比正常肌肉摄取更多的2Omethyls,或许是由于萎缩肌细胞膜上有“洞”。对mdx小鼠全身应用2Omethyls,其水平保持几个月,说明外显子越过治疗可能需要每月反复进行。因而,精确剂量和用药频率还需要进一步研究。由于临床前试验的喜人结果,2007年,荷兰学者准备进行下一个治疗Duchenne患儿的临床试验,目标是全身应用适当的2Omethyl AON越过外显子51和46。短期试验之后进行长期试验,药效持续6个月,可能会显著缓解Duchenne患儿的症状。前两次试验针对的两个外显子已经选定,外显子51越过可对24%缺失突变患儿起效,越过外显子46对所有外显子45缺失突变患儿有效,外显子45缺失是Duchenne患儿中最常见的突变(8%的缺失突变)。除了针对外显子51和46的AON,Prosensa公司还大量生产了其他四种2Omethyls。这六种药物可能对50%以上的缺失突变患者有益。上述试验如能依计划实行,可能要用4~5年的时间,直至针对外显子51和46的2Omethyl AON成为治疗Duchenne肌萎缩的临床药物。这两种药物研制的成功,能够为其他AON的开发积累经验,显著缩短审批和测试时间。Platenburg预备在2007年会议上报告第一次外显子临床试验的结果。

    312外显子越过(英国试验)英国成立了MDEX协作组,致力于外显子越过技术的临床研究,尽最大努力使Duchenne肌萎缩成为可以治疗的疾病。即将进行的试验选择dystrophin mRNA外显子51为目标,患者为9例Duchenne患儿。协作组成员包括:Francesco Muntoni、Kate Bushby、Jenny Morgan、Dominic Wells、George Dickson、Ian Graham、Matthew Wood、Jenny Versne,全部是活跃在Duchenne肌萎缩研究领域的专家。英国卫生部、医学研究委员会也参与了协作。MDEX成员之一,纽卡斯尔大学的Kate Bushby详细介绍了将进行的试验,并提到他们将与国外特别是荷兰研究组进行密切合作。多年的临床研究表明,AON可以“迫使”变异的dystrophin基因制造较短的蛋白——Becker dystrophin,可使Duchenne患儿的严重症状转轻。全身应用AON使实验肌萎缩小鼠的疾病“治愈”。AON已经多年应用于治疗其他疾病,安全无毒。这些成果促使英国学者开展与荷兰研究者并行的试验。有关首次试验MDEX小组已经做了充分的准备:选择外显子51,因为外显子45-50、47-50、48-50、49-50、50、52、52-63等Duchenne缺失突变,约占17%,都可通过越过外显子51治疗。应用AON类型为AON H51A,Steve Wilton实验室开发的morpholinos之一。9例Duchenne患儿,12~18岁,参与试验。009 mg、0297 mg、09 mg AON溶于09 ml溶液,分9次直接注入1 cm3肌肉。注射部位为伸趾肌,人类不太需要这处肌肉,有些人没有。如果出现不能接受的副作用,可以安全地切除这处肌肉。注射前和注射后5周活检,观察用药结果。本次试验的主要目的是确定局部morpholino AON应用是安全的,并至少可恢复一些dystrophin产出。不同剂量的使用是希望10%以上的肌纤维中出现dystrophin。这样就可以估计未来全身应用治疗患者所有肌肉需要的剂量。参加这次试验的患儿仅接受了少量morpholinos,因此不能产生治疗效果。但是,试验的所有结果对实际治疗非常有意义。他们计划在2007年进行更多的试验。

    313外显子越过对小鼠和狗有效,但是要应用于患病儿童,尚需回答一些问题华盛顿国家儿童医学中心的Terence Partridg提出了一些问题,在外显子越过成为有效治疗Duchenne患儿的方法前,迟早要得到回答。Terence Partridg还报道了日本外显子越过技术研究情况,他们对肌萎缩狗局部给予AON产生了效果。我们知道,morpholino AON mdx小鼠尾静脉注射、全身给药,针对外显子23产生了作用。例如,注射后7周,肌肉外观转好,不再乱跳,血清CK值几乎恢复正常。但是,我们不知道AON是否在所有肌肉均匀分布,使全身肌肉都好转。我们还知道morpholino对心肌外显子23无效。同样,其他类型AON,2Omethyls,对心肌的作用也有问题。失败的原因是什么?能否足量应用AON,又使其有效无毒,使患者终生获益?我们可以做组织培养实验,但是同样的结果不一定在动物身上获得。动物可以经受长期实验,又因为狗的寿命比小鼠长,萎缩症狗GRMD、CXMD比小鼠模型外在症状明显的多,也许对狗的实验更可能找到治疗Duchenne肌萎缩的方法。在Shinichi Takeda教授的领导下,日本东京动物研究所开展了对肌萎缩狗的研究。肌萎缩狗dystrophin基因外显子7剪接位发生突变,mRNA外显子7缺失,解读框移位和提前终止编码随即发生。越过外显子6和8可以恢复解读框。三种morpholino AON混合,两种对外显子6,一种对外显子8,混合物由华盛顿的Toshifumi Yokota制备,局部注射入成年CXMD狗胫前肌。注射后两周进行活检。每种AON12 mg溶解于1 ml盐水,注射区周围肌肉纤维全部产生新的dystrophin,外观正常。日本学者下一步进行AON混合物全身试验,在他们的机构,拥有世界上最大的“狗房”。morpholinos AONs对一种与人体结构类似的哺乳动物产生作用,这并不保证其对Duchenne患儿同样有效,作用持续足够长时间。因此,其他类型AON也应该得到研究,Partridge介绍了9种AON的结构。2005年,大量工作是针对morpholinos和2Omethyls的研究,它们已经或即将进入治疗Duchenne患儿的临床试验。由于未来用于外显子越过治疗的药物可能是两者的混合物,而它们的副作用相对独立,药效又互补,所以英国和荷兰同时进行试验是必须的。这对于寻找对心脏有效的物质也有一定的意义。另外,选择最有效的AON序列,确定最小有效剂量-无毒、没有免疫反应,找到最适合的用药方法和治疗间隔都需要连续长期的努力。

    314外显子越过能否使成年Duchenne患者产生新的肌肉Dominic Wells答道:外显子越过产生新的dystrophin将使尚存的肌细胞稳定下来,疾病不会继续进展,是否能重建功能,还没有答案,也许,外显子越过与药物联合,如与antimyostatin药联合,会更有效。对小鼠的联用实验已经进行,示例见附录1。

    32Dystrophin基因转运将充足、完整的dystrophin基因转运至萎缩肌肉细胞核可能对治疗Duchenne肌萎缩有效,只要细胞核糖体利用新的基因遗传信息合成大量有功能的dystrophin,新合成的dystrophin迁移至肌细胞膜的正常位置,与dystrophinglycoprotein复合体蛋白联结。北卡来罗那大学的Xiao Xiao和西雅图华盛顿大学的Jeffrey Chamberlain是活跃在dystrophin基因转运领域的研究者。他们利用类似普通感冒病毒,如腺病毒,作为基因载体。载体病毒已经经过修饰将其扩增基因移除,以使他们不能在感染细胞内扩增。同时为治疗基因编码序列空出位置,编码基因与控制序列结合。基因序列是生产dystrophin蛋白必须的,如:基因cDNA,14,000 bp,包含相互联结的79个外显子,其间没有内含子。腺病毒很容易进入不分裂的肌肉细胞,它们不把所携基因带入目标细胞基因组,它们停留在核内染色体之外。这样,与载体随机结合的其他基因或控制序列就不能干扰细胞活动也不会导致癌变。最适合作为载体,将dystrophin cDNA转运入肌细胞的病毒是腺相关病毒,它比普通腺病毒约小10倍。由于病毒体积小,只能携带不长于5,000 bp的遗传物质,相当于整个dystrophin cDNA的1/3。因此,不得不缩短dystrophin cDNA以适应载体的大小。良性Becker肌萎缩患者的dystrophin就是缩短的。转运小gene cDNA不能治愈Duchenne肌萎缩,只能将其转变为进展较慢的Becker肌萎缩。为了鉴别Dystrophin蛋白的四个域或区(两端区-富半胱氨酸和中央杆域)哪一个是重要的,科学家制造了许多不同形式的短dystrophin cDNA和蛋白。其中一些对mdx小鼠产生了显著的效果。这些人工小dystrophin缺少正常蛋白的中央部分和C-末端。转运这些小基因进入小鼠肌细胞使mdx小鼠肌肉功能改善,肌萎缩症状减轻。此外,转运基因对年轻小鼠的作用更为显著,单次注射后,新合成的dystrophin保持了一年甚至更长时间。

    首次dystrophin基因转运临床试验:Asklepios Biopharmaceuticals(Askbio)公司临床开发部副总监Scott McPhee说,25年前,Asklepios的创始人开始研究腺相关病毒,公司积累了应用这种病毒载体的大量经验,现在已经开发了一种生物纳米颗粒,商品名BiostrophinTM,用于转运小dystrophin治疗Duchenne肌萎缩。经过大量临床前测试,包括动物毒理和生物分布研究,得到执法机关批准,首次临床Ⅰ期试验已经开始,对象为6例Duchenne患儿。本次试验的目的是确定应用这项技术不产生毒性和其他副作用,观察病人肌肉内产生了适当的小dystrophin。美国肌萎缩协会(the Muscular Dystrophy Association of America)为本项研究资助Askbio公司160万美元。如果Ⅰ期试验显示本法安全,耐受良好,可能会追加资助。试验使用的载体是经过修饰的血清型2腺相关病毒-BNP25,小dystrophin基因包含外显子18-59和70-79,不包含外显子17,因此,预期的Becker dystrophin有正常的三分之一长,是因为缺少杆域R3到R21和C末端。俄亥俄州立大学医学院儿童医院的Jerry Mendell指导临床Ia期试验。2006年3月28日,第一个患儿接受Biostrophin注射,分三个位置,相距05 cm,注射于单侧肱二头肌,另一侧注射盐水。本次为双盲试验,只有到整个试验结束才知道哪一侧肱二头肌接受了注射。6例Duchenne患儿,年龄不小于5岁,dystrophin基因突变类型确定,每组3例,分别应用两种剂量。局部注射位置载体浓度大于下一个试验将对全肢使用的浓度。这样,治疗结果较容易获得,也可观察不良反应,如炎症和免疫反应。如果发生严重反应,可能要切除注射区整个肌肉组织,提前终止治疗。毕竟这类基因转运治疗的影响将是长期

    的,因此每一步试验都要慎之又慎。注射后一个月和三个月,提取注射区肌肉组织样本进行活检。样本先被冷冻,全部试验结束后,检查样本中是否含有新的、短的dystrophin。2007年春季,将会得到Ia期试验结果。试验对于受试患者没有治疗意义。下一步,准备对狗和猴的Ib期试验,这项试验可望在2008或2009年进行。那时,将进行全肢截断血流,灌注载体,与化疗药给药研究的过程类似。区域给予治疗也许对提高患者生存质量有益。最后,进行Ⅱ/Ⅲ试验,将全身治疗,参与患者更多,计划在2009~2010年实行。如果试验最终成功,一次治疗就可能阻断患儿Duchenne肌萎缩的进展。

    33干细胞研究Terence Partridge在他的第二个报告中讨论了干细胞,探讨干细胞对Duchenne肌萎缩治疗研究的意义。干细胞可无限复制,同一个干细胞既可复制自身,又可分化为其他细胞类型,这是其两大特征:其一,高度的自我更新或自我复制能力;其二,可分化成所有类型的细胞。干细胞采用不对称的分裂方式:由一个细胞分裂为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性,从而保持身体内干细胞数量相对稳定,这是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类细胞。专门化的细胞可对生命体器官进行修复,维持终生。人类干细胞有不同类型:人类胚胎的前8个细胞,即全能干细胞,可以分化成人体所有类型的细胞,因此得名。受精后4~5天,胚泡内细胞群形成,这些细胞被称为多能干细胞或胚胎干细胞。干细胞交互作用产生细胞系限制性干细胞、定向干细胞和成体干细胞,可以形成一种或几种人体专门化组织。卫星细胞是形成和修复肌肉细胞的成体干细胞。如果肌肉细胞受损,肌细胞外的卫星细胞移至受损区,分裂与肌管融合,发育为成熟的肌肉细胞。一些卫星细胞在新肌肉组织不对称分裂,产生新卫星细胞,在修复后的细胞外占据位置,以备下一轮肌细胞再生之用。卫星细胞可以被注射、移植到受损的肌肉,充当肌源干细胞,修复受损的肌肉组织。这些细胞作用迅速,几天内,少量卫星细胞可制造数千个肌细胞核,然后形成完整的肌纤维。如果来自正常肌细胞外部的卫星细胞携带完整dystrophin基因,新肌肉组织也包含dystrophin,在mdx小鼠实验中观察到了这种现象。但是,对于Duchenne肌萎缩的治疗,在所有肌肉局部注射大量卫星细胞是不可接受的。应用少量注射全身给予,使其进入血液循环,可能是解决的方法,那样所有肌肉,甚至可以到达心和肺。为使干细胞治疗肌萎缩成为可能,必须安全又符合伦理地获得大量成体干细胞来源,细胞可以经过血管注射,以分布全身,必须没有副作用地穿过肌细胞膜。然而,对mdx小鼠的研究,除一个例外,还没有发现符合上述条件的细胞来源。前述所提例外就是成血管细胞(mesoangioblast),是位于肌肉组织小血管外的成体干细胞。意大利Pavia大学干细胞研究所的Giulio Cossu及其同事最近完成了一项基础实验,对于应用干细胞治疗各类肌萎缩有重大意义。他们制作alpha-肌聚糖灭活小鼠取代mdx小鼠模型,alpha-肌聚糖是dystrophin相关复合体的成分蛋白。小鼠具有肢带型肌营养不良症(limb girdle muscular dystrophy,LGMD),与Duchenne临床症状类似。意大利学者从正常小鼠提取成血管细胞,经各类生长因子处理后,注射入LGMD小鼠血循环。这些“健康”干细胞进入小鼠全身骨骼肌,使大约80%正常数量的alpha-肌聚糖复现。为了使这种技术治疗Duchenne肌萎缩成为现实,需将完整的dystrophin基因应用已知载体在体外移入来自患者的成血管细胞,在实验室扩增,然后重新注入患者血循环。这种治疗可能需要定期重复实施,因而,必须避免机体免疫系统的排异反应。目前,这是应用干细胞治疗Duchenne肌萎缩最有希望的方法。其他同类干细胞研究没有获得有益的结果。问题可能出在肌肉,而不是干细胞,科学家将继续为解决这些疑难付出努力。Partridge博士在报告结尾警告说,有许多人宣称不同干细胞治疗Duchenne肌萎缩的潜力,多数不能得到验证,肌肉生物研究中充满了陷阱,有时候富有经验的科学家也可能被蒙蔽。

    4药物方法

    通过早熟终止密码子解读。蛋白质在核糖体上合成,其是由三个有酶活性的大RNA组成,核糖酶,和约80个蛋白质。蛋白质合成信息由mRNA传递到核糖体。在核糖体内部,以20种氨基酸为原料加工蛋白质。TRNA将氨基酸转运到加工位置,tRNA识别mRNA上的三联体密码子。当一个正常的终止密码子到达合成位点,意即蛋白质加工已经完成。特殊蛋白质、释放因子,进入加工位置,使合成停止,核糖体释放完成的蛋白质。10%~15%的Duchenne患儿在dystrophin基因上有点突变,一个氨基酸转变为终止密码子之一——TGA、TAG、TAA。在mRNA密码子变成UGA、UAG、UAA,造成dystrophin合成提前停止。

    41庆大霉素抗生素庆大霉素能够干扰核糖体中mRNA翻译机制,忽略早熟终止密码子。例如,通过终止密码子解读。应用庆大霉素于携带dystrophin mRNA早熟终止密码子的动物模型显示,正常长短,有功能的dystrophin的产出部分恢复。然而,庆大霉素毒副作用强,必须静脉给药,长期用药治疗Duchenne肌萎缩症不太适当。如果改良的readthrough技术能够发展成为治疗Duchenne肌萎缩症的方法,无疑突变类型的患者将从中获益。临床前小鼠实验显示,新的dystrophin产生,不能治愈疾病,但可以使其转变为Becker肌萎缩。如果readthrough发生在蛋白质合成水平,不在基因水平,治疗必须每日进行。只有知道Duchenne患儿dystropin基因存在点突变,其引入了三种终止密码子之一,才能确定readthrough药物可以治疗Duchenne肌萎缩症。

    42PTC 124PTC Therapeutics公司首席医学官Langdon Miller报道了PTC124开发和临床测试情况。PTC124是一种新的化合物,在reading through premature stop codons比庆大霉素更有效。以readthrough技术治疗Duchenne肌萎缩症和囊纤维化是PTC的两大优点。几千种化合物得到自动测试,从中寻找dystrophin和CFTR蛋白对应mRNA中的readthrough premature stop codons,在囊纤维化中缺乏CFTR蛋白。许多化学变异使最有希望的化合物结构改变,直至发现目标化合物——PTC124,其作用优于庆大霉素。在Duchenne肌萎缩项目中,细胞培养实验获得了接近正常数量、正常长度的dystrophin;口服PTC124后,超过25%的mdx小鼠肌纤维功能和结构得到恢复。未检测到readthrough of normal stop codons。对大鼠和狗的毒理研究显示:高剂量给药未产生严重急性副作用。这种药物为粉末状,可以制成口服片剂。为测试PTC124临床作用,在成年健康志愿者中进行了两次一期临床试验。研究显示:PTC124是安全的,仅有少量副作用。2005年,PTC124二期临床试验在15例囊纤维化患者中进行。结果表明,PTC124能够恢复患者CFTR功能,未见严重不良反应。为测试PTC124对Duchenne患者的作用,美国三个临床中心开始进行这方面的研究。22例5~12岁Duchenne患儿参加了试验,他们的dystrophin基因中有未成熟终止密码子。研究持续8周。研究中,6例每日给予低剂量PTC124 3次,用药4周,随访4周。6例中未发现副反应,随后16例患儿接受大剂量PTC124 4周,随访4周。为评估试验效果,治疗前后进行肌肉活检,观察是否有部分正常dystrophin恢复产出。另一个化学和功能试验测试了PTC124在患儿中的量效关系。研究结果将在2006年底得出。如果PTC124在临床前开发阶段获得阳性结果,并得到欧洲、美国立法机构审批。三期临床试验将在2007年或2008年进行。

    43Utrophin上调Utrophin是一种与dystrophin结构和功能非常类似的蛋白质。Utrophin基因位于人类染色体6,75个外显子,约1百万碱基对上。Utrophin比dystrophin短约7%,分布在许多身体组织中,包括肌肉组织,在神经肌肉接头部位富集。Utrophin有两种,A和B结构类似。肌肉中仅有A型错误。人类出生前,体内含量高于出生后。被敲除utrophin基因的mdx小鼠体内没有dystrophin和utrophin,产生Duchenne样症状,比肌肉损害轻的mdx小鼠提前死亡。小鼠实验表明,体内存在大量utrophin,可以代替dystrophin行使功能。这些生殖系中含有小utrophin基因的转基因小鼠,仅用作实验,该技术不适于人类。随着utrophin水平的提高,肌萎缩症状的进展被阻止,肌肉功能可完全恢复。最近研究发现,体内有较高含量utrophin的Duchenne患儿比含量正常的患儿失去行走能力晚。说明增加utrophin含量可产生与小鼠实验中预防和阻止肌肉退化类似的作用。本方法用于治疗Duchenne肌萎缩,必须通过上调基因活性增加utrophin含量。为了达到此目的,必须找到一种激活物,这种物质最好是一种已知的药物,或化合物或天然物质,能够与基因启动子发生反应。这种化合物的小分子应能够很容易地进入肌细胞。如果是一种已知的药物,便可省去冗长的审批时间。牛津大学的Kay Davies和她的小组在用utrophin取代dystrophin的研究中进行了多年开拓性的工作。她在报告中说,她们与VASTox plc公司在牛津进行合作,从数千种化合物中筛选能够上调mdx小鼠utrophin基因活性的物质。她们用荧光素酶作为试剂检测utrophin基因活性。她们发现了几种候选物质,现在正进行肌细胞培养和mdx小鼠实验,以选出最适合的物质,观察物质是否能充分提高动物全身肌肉的utrophin含量。一种最有希望的活性物质已经通过在小鼠腹部注射进行了测试。它只与肌肉中的A型utrophin反应。该物质可使小鼠骨骼肌Autrophin上调2~3倍,但是能否上调心肌utrophin还不清楚。每周注射1次,12周后,小鼠肌肉功能显著恢复。这种活性物质经过进一步化学修饰后,可望于2008年开始进行Duchenne患者临床试验。

    44蛋白酶抑制几种蛋白酶可以导致Duchenne肌萎缩患者肌肉蛋白退化,如钙蛋白酶和大蛋白酶复合物-蛋白酶体。Dystrophin缺乏使肌细胞膜破裂,钙离子外溢在细胞外激活钙蛋白酶,也间接激活蛋白酶体。酶活性的增加致使对肌细胞功能和存活所必需的重要细胞蛋白质广泛破坏。特别设计的抑制物可以阻滞钙蛋白酶和其他蛋白酶活性,进而延缓肌细胞退化。经过修饰的三肽leupeptin第一个被鉴别出的钙蛋白酶抑制物,在小鼠实验中获得了成功。第一代抑制物由三个氨基酸、两个leucine、一个arginine构成,arginine包含aldehyde,是产生抑制活性的基本结构。然而,leupeptin也抑制其他蛋白酶,包括血浆凝血机制所必需的酶,导致严重副反应。同时,leupeptin也可能抑制蛋白酶体。

    45C101巴尔的莫CepTor公司临床研究部副总监Theresa Michele介绍了一种leupeptin和carnitine的结合物-抑制剂C101。C101只进入骨骼肌和心肌细胞。这种特性的获得是由于存在一种carnitine转运蛋白OCTN2,OCTN2与C101 carnitine末端结合,将C101带到肌细胞膜受体蛋白,随后穿过肌细胞膜进入细胞。为了精确测量C101等物质的效果,开发了一种新的定量方法,用于分析钙蛋白酶诱发的动物和人类肌细胞蛋白分解。本方法能够测量钙蛋白酶劈开肌细胞alpha-Ⅱ-血影蛋白的能力。钙蛋白酶分两步将血影蛋白分解成两个小蛋白-SBDP150、145,专门设计的抗体可以检测到进入血液的SBDP150、145。新测试法可以追踪肌肉退化的进程,对于临床研究Duchenne肌萎缩将产生重要作用。本方法显示:C101对钙蛋白酶的抑制作用比leupeptin强50~100倍。在mdx小鼠实验中,C101使肌肉结构得以保存,并增加了肌纤维直径,效果显著。C101可以口服,是治疗Duchenne肌萎缩的潜在药物。

    46BBICLee Sweeney在他的报告中提到了BowmanBirk抑制浓缩物(BowmanBirk inhibitor concentrate,BBIC)。BBIC可抑制除钙蛋白酶之外,破坏肌蛋白的蛋白酶。BBIC的活性成分是一种71个氨基酸组成的天然蛋白质,可以从大豆中分离提纯得到。Mdx小鼠长期服用BBIC,肌肉质量和力量得到增加。CK活性和纤维化程度显著降低。BBIC在癌症患者中的应用是安全的,可以口服。

    47SNT 198’438瑞士Santhera Pharmaceuticals公司首席科学家Thomas Meier介绍了他们的临床前研究。他们开发了一种能够同时阻滞钙蛋白酶和蛋白酶体复合物的双重特异性抑制剂。从一种已知的钙蛋白酶抑制剂开始,Santhera公司的科学家共合成了800多种化合物变体,对这些化合物进行了生化、细胞培养和mdx小鼠实验。鉴别出了几种有研究意义的化合物。SNT 198’438是最适合的一种。SNT 198’438可经皮下注射。因此,可到达全身所有肌肉组织。Mdx小鼠可安全耐受SNT 198’438的作用,SNT 198’438使肌肉组织参数正常化,改善动物运动能力。运动实验在一个大型“老鼠体育馆”进行,40多只小鼠在计算机监控的跑步装置上随意运动数星期。

    48保护线粒体的SNT-MC17/idebenoneSanthera Pharmaceuticals正在开发一种保护线粒体的药物。Thomas Meier在他的报告第二部分介绍了这种化合物-idebenone或SNT-MC17,在美国和欧洲正在进行SNT-MC17治疗Friedreichs共济失调的三期临床试验。Friedreichs共济失调是一种神经肌肉病,与心肌病高度相关。SNT-MC17/idebenone是强力抗氧化剂,带有衍生自天然辅酶Q10的化学结构。SNT-MC17/idebenone化学结构比辅酶Q10短,侧链不同,更容易进入肌细胞。SNT-MC17/idebenone也可易化线粒体中ATP的产出。该药可以制成片剂口服。

    49DystrophinDystrophin缺乏对Duchenne肌萎缩患者心肌细胞线粒体氧化磷酸化有负面作用,对骨骼肌可能有同样的影响。Gunnar Buyse博士领导的比利时研究组正在对SNT-MC17/idebenone进行Iia期双盲对照临床试验。21例8~16岁Duchenne患儿参加了试验。本试验的首要目的是研究SNTMC17/idebenone对心肌的影响。同时,还研究了SNTMC17/idebenone对Duchenne患儿肌肉力量的影响。试验组患儿口服片剂150 mg,3次/d,对照组服用安慰剂,研究持续12个月。研究题为“长期大剂量应用Idebenone对Duchenne肌萎缩的效果研究”(Duchenne Efficacy Study in Longterm Protocol of High dose Idebenone,DELPHI)。可望1年内获得结果。

    410Poloxamer 188修补细胞膜洞口的“创可贴”。有学者设想了一种挽救心肌病肌细胞的方法:关闭萎缩肌细胞膜上的洞口。密歇根大学的Joseph Metzger报道了本疗法对Duchenne肌萎缩症的作用。Mdx小鼠和Duchenne患儿缺乏dystrophin蛋白不仅影响骨骼肌,对心肌功能的影响也会带来严重的后果。一种专门设计的聚合物——poloxamer 188或P 188,对mdx小鼠心肌功能产生了积极效果。为了观察P 188对分离的mdx小鼠心肌细胞的作用,应用两条可移动的碳纤维联结单个细胞。由于小鼠心肌细胞比骨骼肌细胞短上千倍,微碳纤维间的距离只有18~22 μm。正常肌细胞能够持续收缩和舒张数小时,mdx小鼠肌细胞纤维顺应性降低,纤维阻抗伸展,呈现过度收缩状态,断裂最后死亡。应用这种显微测量方法发现P 188可以使mdx小鼠和肌萎缩GRMD狗心肌细胞恢复顺应性。Mdx小鼠体内应用P 188可以阻止急性心衰竭的进展,运用小导管插入活鼠心脏观察效果。P 188是一种人工共聚物,有一个35个疏水单位组成的核,75个亲水单位组成两翼。Metzger博士把这种共聚物叫做“分子信天翁”,中心疏水结构插入疏水性细胞膜内部,两翼像创可贴的粘贴端与细胞膜洞口周围结构完整部分黏结,封闭开口。由此,钙离子不能溢出激活钙蛋白酶及其他蛋白降解酶。显然,polaxamer 188对心肌的保护作用也可用于萎缩的骨骼肌。已经有学者做过尝试,但没有获得预期的结果。这方面的研究正在进行当中,或许可以为治疗Duchenne肌萎缩症开辟一条新路。

    411肌肉生长抑制素(myostatin)抑制剂myostatin是肌细胞内产出的一种非活性蛋白质,由375个氨基酸组成。经过一系列分子结构重组之后,myostatin转变为活性蛋白,在细胞内促发连续化学反应,导致肌肉蛋白生物合成所需的酶水平下调。因此,抑制myostatin活性,可能会刺激Duchenne患儿肌纤维再生,阻止肌纤维的破坏,或仅仅增加其体积。应用遗传方法,敲除非肌萎缩小鼠的myostatin基因,其肌肉容积比正常大,肌纤维增多,肌纤维直径增加。比利时蓝种牛的肌肉非常发达,就是由于几百年前的变异使myostatin基因失活造成的。在柏林,有一个7岁的男童,他的骨骼肌比同辈容积大一倍,体格强壮,他的母亲是奥运长跑运动员Olympic runner,亲属中也有几个非常强壮。原因是突变使其家族成员的3个myostatin外显子正常剪接改变。说明下调myostatin可以使Duchenne患儿肌肉生长加快。

    412Myo 029约翰霍普金斯大学Wellstone肌萎缩研究中心的Kathryn Wagner报道,她的研究小组饲养了没有dystropohin和myostatin的mdx小鼠。敲除myostatin基因的小鼠比其他mdx小鼠肌肉多,纤维化和瘢痕组织少见,肌肉再生快。与Lee Sweeney一起,同样的试验将对肌萎缩狗实施。现在关注的是缺失myostatin能否对心肌有同样的作用,是否会造成心肌病,增生的心脏对Duchenne患儿一样是有害的。幸而,最近对mdx小鼠的试验表明,阻滞myostatin对心脏没有影响。说明myostatin的活动局限于骨骼肌。与Wyeth Pharmaceuticals公司协作进行了一项不同剂量Myo 029的Ⅰ/Ⅱ期临床试验,对象为36例成年肌萎缩患者。Myo 029是一种特异性抗体,它与myostatin结合,使myostatin失活。因为Myo 029的结构与一种人类蛋白质相同,所以它不会造成免疫排异反应。Myo 029可以通过皮下注射进入血液循环。如果试验成功,Wyeth Pharmaceuticals公司将致力于Myo 029的临床推广。现在,家长们一定不要通过网络购买任何所谓的myostatin抑制剂,那些化学物没有经过临床研究,可能是无效的,甚至是危险的。

    413上调胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)IGF-Ⅰ是含有70个氨基酸的多肽,结构与胰岛素类似。人体可产生六种结构略有差异的IGF-Ⅰ,但最终产物为IGF-Ⅰ蛋白。IGF-Ⅰ对肌肉非常有益,因为它促进肌肉生长,增强肌肉力量。然而,IGF-Ⅰ的作用不仅仅局限于肌肉。卫星细胞被损伤或蜕变激发,胞膜产生可与IGF-Ⅰ结合成特异性受体蛋白,卫星细胞随之增殖,进一步发展成肌管和肌纤维。肌纤维的这种再生对于保持萎缩肌组织有重要意义。因此,IGF-Ⅰ可能应用于Duchenne患儿的治疗。然而,IGF-Ⅰ也对其他组织产生作用,IGF-Ⅰ在血液中的水平增高也可能增加癌变的风险。为了使IGF-Ⅰ成为治疗肌肉疾病的药物,必须研究降低IGF-Ⅰ组织副作用的策略。宾夕法尼亚大学Elisabeth Barton研究组建立了一种转基因mdx小鼠模型,小鼠肌肉组织可产生高水平的IGF-Ⅰ,转基因mdx小鼠肌肉生长加快,肌肉外观与正常类似,比一般mdx小鼠更少出现纤维化,这项工作证明IGF-Ⅰ可能用于Duchenne患儿的治疗。但是,IGF-Ⅰ干扰细胞内信号通路系统,有利于肌肉的剂量可能又会带来其他严重后果。为此,开发了IGF结合蛋白3,一种血流中的正常蛋白质,IGF-Ⅰ与IGF结合蛋白3混合应用,混合物只在必要时间必要位置释放IGF-Ⅰ,也可以使蛋白质在血流中保持稳定,本物质不能大量注射。FDA已经批准了一种同类药物,品名IPLEXTM,用于IGF-Ⅰ缺乏引起的儿童发育失常。经NIH和MDA批准,罗切斯特大学正在进行IPLEX的临床试验,对象为15例强直性肌营养不良患者。IPLEX最适剂量研究将在2007年进行。这种方法可以使IGF-Ⅰ只对肌肉起效,不损害其他组织。直接将IGF-Ⅰ基因运入肌肉同样可以产出高水平的IGF-Ⅰ腺相关病毒等可以作为载体达到此目的,IGF-Ⅰ基因在肌肉内制造更多IGF-Ⅰ。Barton博士的实验室应用本法进行了实验。实验结果显示,IGF-IA是促进肌纤维增生的有效物质。目前,肌注AAV载体携带IGF-Ⅰ基因,可以使IGF-Ⅰ水平提高30~40倍。新合成的IGF-Ⅰ保留在肌内,不外溢入血,因此,避免了对其他组织的影响。病毒基因疗法用于Duchenne患儿尚需数年的研究。该研究鉴别出了最佳形式的IGF-Ⅰ用作肌营养不良的治疗。

    5催化剂项目:自动化药物筛选

    PTC Therapeutics 公司的Ellen Welch介绍了催化剂项目,项目两年前启动,受PPMD支持。应用现代自动化技术,PTC Therapeutics这样的小公司也能够做到从200,000多种化合物中筛选备选药物,筛选出的物质可望达到上述提到的作用:utrophin上调、myostatin下调、同形IGF-1上调,加上alpha-7整合素上调。开发PTC124用于stop-codon read-through的经验优化了自动化筛选过程,调控四种目标药物分子活性。报告蛋白系统(reporter protein system)是测量方法的基础。在目标mRNA[未翻译区(UTRs)]末端发现四种目标的不同调节序列与荧光素酶结合。将荧光素酶引入肾脏细胞,其光强度不是增加就是减弱。大量主要非活性化合物光强度改变不显著。自动精确测量小量样本光强度比分析utrophin、myostatin、IGF-1、alpha-7整合素等的生物学作用要容易。对四类目标化合物每类进行两次大规模筛选。从200,000物质中鉴别出几种具有上调utrophin、IGF-1、alpha-7整合素或下调myostatin作用的化合物。它们都具有某些需要的特性,现在正进行结构优化工作。这项工作将占用许多化学家几年的时间,如,优化read-through药物PTC 124,对原始结构进行了4,000余次化学修饰,实验室工作耗用两年的时间。以后的新药临床前开发还需要几年的时间。除了结构改造研究,详细观察活性分子生物特性的细胞培养实验和动物毒理实验、代谢实验、药效实验等都要开展,希望生化改变对活体没有副作用。这些化合物对Duchenne患者疗效的临床试验还需要更多年的时间。

    51抑制TGF-beta澳大利亚南昆士兰大学的Andrew Hoey在他的报告第一部分介绍了纤维化和阻止纤维化的可能途径。过量的结缔组织产出及其在骨骼肌和心肌纤维组织间的沉积(取代退化和丢失的纤维),是导致纤维化或瘢痕组织的原因。在正常情况下,结缔组织使肌纤维结合在一起,过量则导致肌肉僵硬紧缩。结缔组织的主要成分为胶原蛋白,一种无弹性的分子,由纤维母细胞产出。生长因子用于Duchenne肌萎缩、退化和再生进程中,结缔组织可增生,TGFbeta是其中一种生长因子。TGFbeta促进不同胶原分子合成融合形成没有弹性的结缔组织。抑制TGFbeta活性可能是减少纤维化的机制之一。Pirfenidone是一种用于治疗肺纤维化的上市药物,可能有这样的作用。给予8个月龄成年mdx小鼠Pirfenidone,7个月后,TGFbeta水平降低,心功能接近恢复,但是没有减轻纤维化程度。该药对年轻mdx小鼠的作用实验将在未来进行。

    52L-精氨酸和nNOS在他的报告第二部分,Andrew Hoey讨论了dystrophin丢失的另一种后果:dystrophinglycoprotein成分之一——神经元型一氧化氮合酶(nNOS)数量减少。通过L-精氨酸产出NO。虽然,NO是一种气体,但它的作用类似激素和调节剂,NO扩张血管,增加血供,为肌肉提供能量。nNOS流失造成心脏纤维化,或许是mdx小鼠和Duchenne患者心脏纤维化的原因。

    每日给予6个月龄mdx小鼠L-精氨酸,持续6个月,小鼠心脏纤维化程度降低,冠脉血流增加,心功能改善。在研究L-精氨酸对Duchenne患儿的效果之前,L-精氨酸作用机制研究还将持续进行下去。

    53致炎物质阻滞肌细胞降解和死亡启动炎症反应进程,清除细胞碎片。类固醇可抑制炎症反应,这也许是强的松能够增加肌肉容量和力量,减少免疫反应的原因之一,但是其副作用不可忽视。现在,类固醇广泛用于维持Duchenne肌肉功能,作用至少可持续几年。作用机制不完全清楚。洛杉矶大学Melissa Spencer博士实验室的研究生Sylvia Lopez报道了炎症与免疫反应交互作用的实验研究。实验目的是找出取代类固醇的方法,减少免疫介导损害。研究显示:CD4、CD8细胞水平增加加速疾病进程,抑制CD4、CD8可以使mdx小鼠萎缩症状减轻,对无dystrophin、utrophin mdx小鼠(utr-/mdx)作用显著,utr-/mdx小鼠寿命延长。另外,细胞因子(促炎促纤维化分子)数量在mdx小鼠和Duchenne患者肌肉中增加。因此,抑制或移除CD4、CD8细胞,调制细胞因子活性,可能减慢萎缩心肌降解。如果市面上已有的抗炎药物能够对Duchenne肌萎缩产生作用,也可节省相关药物审批时间。Spencer博士的实验室对三种有希望治疗Duchenne患者的药物进行了测试。这些药物已经做过对其他疾病的临床试验:CTLA-4Ig,抗类风湿性关节炎,Galectin-1正在进行治疗关节炎的临床试验,具有促进肌肉再生作用,Antiasialo GM1是一种抗体,用于Parkinson病的治疗。随后进行另四种药物的测试:RaptivaR,治疗银屑病;TisabriR,治疗多发性硬化和Crohn病;RemicadeR、EnbrelR,治疗类风湿性关节炎等。长期治疗研究必须确定这些药物是否可用于Duchenne肌萎缩治疗,是否能够改善患者生存质量。当肌肉依赖utrophin,不需要dystrophin时,Biglycan对幼小鼠非常重要。

    54双糖链蛋白多糖(Biglycan,BGN)会议结尾,布朗大学的Justin Fallon报道了一则“重大新闻”。他介绍了一项意外发现,可能对Duchenne肌萎缩治疗研究有帮助。过去8年,他的实验室一直在研究细胞外蛋白-双糖链蛋白多糖(BGN)。至今,对这种蛋白质的具体情况还不甚了解,它联结骨骼肌膜外alpha和gammasarcoglycan两末端。在对敲除BGN基因的小鼠的实验中发现,小鼠体内dystrophin复合物显著减少。局部或全身给予BGN可使betasyntrophin再次出现,说明dystrophin复合物水平恢复。最新研究说明,给予mdx小鼠BGN可以局部对抗萎缩肌肉病理进展。BGN在小鼠体内浓度较低,因此免疫反应没有出现,或许在人类也是如此。Alpha和 gammasarcoglycans仅存在于骨骼肌和心肌,而BGN与两种蛋白都联结,也许BGN对心肌和骨骼肌都有影响,而且副作用轻微。为优化治疗条件,动物实验将继续进行。Biglycan的Ⅰ期临床试验可能在2年内进行。

    6Mdx小鼠症状轻微的原因

    科罗拉多大学的Brian Tseng及其研究小组注意到了这个问题。外显子23提前终止密码子(premature stop codon in exon 23)造成mdx鼠dystrophin缺失,但是小鼠没有出现与人类Duchenne肌萎缩同样的临床症状,显得非常健康。例如,小鼠在跑步机上每晚可以跑5~6 km,寿命近两年,与正常无异,在鼠群中分不出哪只是模型鼠。mdx鼠具有与Duchenne肌萎缩相似的实验室指标,如:高水平血清CK;细胞核居中;轻微纤维化;膈肌病变,但呼吸衰竭未见。Mdx小鼠研究能否引导我们找到将Duchenne肌萎缩转变为良性dystrophin缺乏形式的肌萎缩,Tseng博士相信,mdx小鼠体内有上调的修饰基因,但是在Duchenne患儿中下调。

    utrophin、卫星细胞、回复突变体纤维上调,myostatin下调是受修饰基因的影响,在mdx小鼠和Duchenne患儿中都有表达。Tseng博士最感兴趣的是,基因在mdx小鼠和Duchenne患儿中的反方向表达。可能存在其他修饰基因引起不同的疾病症状。Tseng博士和同事们应用大规模自动筛选技术,在mRNA水平分析30,000种骨骼肌基因,对成年mdx小鼠和正常小鼠进行比较。他们发现,有45种在mdx小鼠体内上调的基因,在Duchenne患儿体内下调。其中两种最有研究价值,Arginine:glycine amidotransferase,AGAT基因和guanidinoacetate methyltransferase,GAMT基因。它们是生物合成肌酐所必需的基因,肌酐对肌肉收缩供能和细胞健康有重要作用。在mdx小鼠体内两种酶上调,因此,mdx小鼠肌肉能够制造肌酐。Tseng博士认为,mdx小鼠和Duchenne患儿缺乏dystrophin导致肌肉细胞膜上的肌酐转运蛋白出现问题,因此,口服肌酐效果不大。看来mdx小鼠AGAT、GAMT上调和肌酐转运蛋白错位是缺乏dystrophin的继发后果。灭活小鼠GAMT基因,小鼠行走失常,很快死亡,肌肉结构与Duchenne患儿肌肉活检结果相似。Duchenne患儿肌肉内肌酐水平只有正常的20%,而mdx小鼠肌酐水平是正常的80%~90%。这可能是Duchenne患儿症状比mdx小鼠更为严重的原因之一。这些和其他差异的进一步观察,也许能够帮助解释mdx小鼠为何症状不甚明显,为治疗Duchenne肌萎缩寻找新的疗法。大规模筛选是方法之一,催化剂项目很可能寻找到这些修饰基因。安全启动修饰基因功能可缓解Duchenne患儿症状,可能是其合理的目标。

    7查明突变类型的意义

    尤他大学的Kevin Flanigan回答了这个问题。诊断患儿是否患有Duchenne肌萎缩,必须知道其准确的突变类型以确定诊断,与其他肌肉疾病相区别,如:一种肢带萎缩症状与Duchenne肌萎缩类似。尽管突变类型不能完全区分Duchenne肌萎缩和Becker肌萎缩,但是,如果突变使dystrophin解读框移位,Duchenne肌萎缩的可能性非常大。此外,在许多情况下可以避免活检。同等重要的是,知道准确的突变类型,有利于进行可靠的遗传咨询,患儿家族中的Duchenne携带者可以被检出。最后,新的疗法,如:外显子越过法、stopcodon readthrough药物,需要知道患者dystrophin基因突变情况。为探查缺失和增添突变。现在广泛采用的方法是多重连接探针扩增法(multiplex ligationdependent probe amplification method,MLPA),由荷兰阿姆斯特丹MRC公司的Jan Schouten博士研发。方法简介:特殊序列158个寡核苷酸与79个dystrophin外显子中的每一个有两处结合位点。如果某个外显子存在,两个核苷酸与其紧密结合,结合体作为PCR扩增的模板。扩增产物在电泳图上出现峰值,如果这个外显子不存在,电泳图上则不出现峰值。这种技术可以检测出所有79个dystrophin基因外显子的缺失突变和增添突变,但不能检出点突变。由于这是一种定量方法,其可以检出Duchenne携带妇女两个dystrophin基因之一的缺失突变和增添突变,甚至并不知道相关患者的缺失突变和增添突变的存在,这是该技术最具优势的特点之一。然而,也可能出现假阳性结果,当MLPA探针与基因序列结合的位置出现多态性,就会错认为并不缺失的外显子不存在。多态性是指DNA某个碱基出现非致病性改变。因此,MLPA法检出的单个外显子缺失,需要得到其他方法的确证。如果应用MLPA法没有发现突变,患者就可能是点突变。由Flanigan博士实验室发展的单个扩增/内部引物测序技术(single condition amplifiation/internal primer sequencing technique,SCAIP),可能检出所有类型的点突变。包括终止密码子、小的缺失和插入、剪接位突变。方法分两步,dystrophin基因所有外显子全碱基序列;内含子、外显子与剪接信号边界区;所有启动子都能得到检测。首先应用PCR技术扩增分离的基因区,然后直接应用标准自动化基因测序技术检测点突变和其他类型突变。应用MLPA和SCAIP技术对血样检测,可以发现93%~95%的突变。只是其余5%~7%突变类型还需要开发其他技术。如果患者有明显的Duchenne 或Becker肌萎缩症状,但从血样中无法检测出突变,就必须进行肌肉组织活检。为了确定dystrophin蛋白在肌肉中存在与否,可以运用两种蛋白质检测法之一进行,western blot或免疫荧光法。Western blot可检测dystrophin蛋白的数量和大小,而免疫荧光法更为方便。从肌肉组织抽提mRNA可用于查找一种罕见的突变,这种突变可导致内含子片段搀入DMD gene基因外显子。因为Duchenne 和Becker肌萎缩患者的dystrophin基因突变的准确数据和他们的临床症状数据越来越重要,数据的积累不仅对患者有益,而且治疗研究和临床试验设计都很重要。为此,Flanigan博士实验室与美国国内六个州的临床中心协作建立了一个通用诊断数据库。美国其他州甚至是国外的研究中心和专家也受邀将他们的患者数据送往尤他中心。未来将进行更多的临床研究,研究者需要对突变和症状有明确的概念。

    (以下省略部分是Güenter Scheuerbrandt博士与Stephen D.Wilton博士的谈话)附录1外显子越过技术示例

  作者单位: Im Talgrund 2,D-79874 Breitnau,Germany

     (翻译:侯克俭编辑:杨熠)

作者: Güenter Scheuerbrandt 2007-4-26
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