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【摘要】 目的 检测黏附分子CD44v6及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在子宫内膜异位症（EMT）在位、异位内膜与正常内膜中的表达，检测可溶性CD44v6及MMP-2在正常妇女与子宫内膜异位症患者血清及腹腔液中的水平，探讨CD44v6及MMP-2在EMT发病中的作用。 方法 采用免疫组化法对子宫内膜异位症异位内膜（40例）、在位内膜（35例）与正常子宫内膜（35例）中CD44v6、MMP-2的表达进行检测，酶联免疫吸附法（ELISA）检测正常妇女与EMT患者血清、腹腔液中可溶性CD44v6与MMP-2的水平。 结果 CD44v6、MMP-2在卵巢子宫内膜异位囊肿异位内膜中的表达显著高于同期在位内膜与正常子宫内膜的表达（P<0.01），在位内膜与正常子宫内膜中CD44v6、MMP-2表达差异无显著性（P>0.05），分泌期的表达显著高于增生期（P<0.01）。可溶性CD44v6、MMP-2在EMT患者血清、腹腔液中的水平显著高于正常妇女（P<0.01）。 结论 异位内膜组织中CD44v6与MMP-2的高表达之间有高度相关性，CD44v6及MMP-2在异位内膜中高表达可能与子宫内膜异位症的发生发展有关。
关键词 CD44v6 基质金属蛋白酶-2 子宫内膜异位症 免疫组化法 酶联免疫吸附试验
Expression and significance of CD44v6and MMP-2 in human endometriosis
Gao Hui，Zhang Xiangning，Zhang Zhen
Department of Obstetrics and Gynecology，The People's Hospital of Linyi，Shandong276000.
【Abstract】 Objective To evaluate CD44v6and MMP-2expression in endometriotic and eutopic endometri-um in women with endometriosis and normal endometrium.To assess the changes of serum and ascites levels of soluble CD44v6and MMP-2in women with endometriosis and normal women.Methods CD44v6and MMP-2expression was examined in endometriotic（n=40）and eutopic endometrium（n=35）and normal endometrium（n=35）by im-munohistochemistry.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to measure serum and ascites soluble CD44v6and MMP-2from40women with endometriosis and35normal women.Results Increased expression of CD44v6and MMP-2in endometriotic was found as compared with eutopic and normal endometrium（P<0.01）CD44v6and MMP-2expression was similar in the last two groups（P>0.05）.The soluble CD44v6and MMP-2levels in serum and ascites in EMT patients were significantly higher than those in normal women（P<0.01）.Con-clusion Our results suggest there are close relationship between CD44v6and MMP-2，which are overexpressed in endometriotic tissues，CD44v6and MMP-2could be involved in the development of endometriotic lesions.
Key words CD44v6 matrix metalloproteinase-2 endometriosis immunohistochemistry enzyme-linked immunosorbent assay
子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）是指具有生长功能的子宫内膜组织，出现在子宫腔被覆黏膜以外的身体其他部位。本病具有种植生长、侵袭、远处转移和易复发等类似恶性肿瘤的特点，常引起盆腔和腹部疼痛和不孕，严重影响妇女生活质量，被称为一种“良性癌症”。
EMT的发病机制至今尚不清楚，有子宫内膜种植学说、淋巴及静脉播散学说、体腔上皮化生学说及免疫学说等。经典的子宫内膜种植学说提出，经期时经血中所含的子宫内膜碎片可随经血逆流，经输卵管进入腹腔，种植于卵巢和邻近的盆腔腹膜，并在该处继续生长和蔓延，以致形成子宫内膜异位症。子宫内膜种植学说虽为大家所公认，但经血逆流在生育期妇女中非常普遍，发生率可高达80%～90%，并且无EMT的妇女腹腔液中都证实有存活的内膜细胞，而EMT的患病率仅占10%～15%，说明经血逆流只是诱因，探讨子宫内膜在腹腔中种植生长的机制，应是认识EMT发病的关键。
近期文献表明，子宫内膜细胞在异位种植生长时，必须具备黏附（attachment）、侵袭（aggression）和血管生成（angio-genesis）三个基本环节。
子宫内膜细胞的异位种植生长过程中存在着内膜细胞之间以及内膜细胞与细胞外基质（ECM）黏附和解黏附的问题。目前已证实黏附分子CD44v6及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）与恶性肿瘤关系密切，因而我们对黏附分子CD44v6及MMP-2在EMT中的表达进行检测，探讨CD44v6及MMP-2在EMT发病机制中的作用。
1 资料与方法
1.1 资料的选择
1.1.1 卵巢子宫内膜异位囊肿组 以2003年1月～2004年1月在我院就诊的因EMT手术治疗者40例作为研究对象，年龄30～45岁，无其他内外科疾病，术前3个月内未使用EMT治疗药物、性激素类药物或放置宫内节育器。术后病理组织学检查证实。异位内膜取囊肿内壁，在位内膜为上述病例诊刮所得内膜。
1.1.2 正常子宫内膜组 将同期在我院就诊的因结扎术后要求再生育而行输卵管吻合手术、证实无EMT者35例作为正常对照组，年龄30～45岁，有正常生育史且月经周期规律，诊刮取其内膜病理组织学检查未发现异常。术前3个月内未使用性激素类药物或放置宫内节育器，无其他内外科疾病。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化法检测CD44v6、MMP-2的表达 所有标本进行HE染色和免疫组化染色，实验过程严格按说明书进行。鼠抗人CD44v6及兔抗人MMP-2单克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（S-P）免疫组化试剂盒（即用型）均为美国Maxim公司产品，购自福州迈新生物技术公司。用已知阳性的卵巢癌标本作阳性对照，阴性对照以PBS代替一抗。胞膜和（或）胞浆内呈现棕黄色颗粒反应为阳性，无棕黄色颗粒反应为阴性。表达强度计分标准参照Remmele and Stegnerde的IRS ［1］ 3个参数的半定量计数方法，见表1，即阳性细胞数（A）、删色深度（B）和两者计分的乘积。光镜下随机观察染色清晰的10个高倍视野共计数1000个腺上皮细胞阳性的百分比，结合着色强度，按表1的方法予以半定量评分。每例标本最后得分为A项×B项，0分为阴性（-），1分为弱阳性（+），2～3分为阳性（++），>3分为强阳性（+++）。
表1 免疫组化染色计分标准（略）
1.2.2 血清、腹腔液中可溶性CD44v6、MMP-2的测定 酶联免疫吸附法（ELISA）检测正常妇女与EMT患者血清、腹腔液中可溶性CD44v6与MMP-2的水平。严格按照说明书标准进行操作。EMT患者血清、腹腔液中所测可溶性CD44v6、MMP-2的A值大于正常妇女的ˉx±3s值为结果阳性。
1.2.3 统计学方法 采用SAS医学统计软件进行统计学分析，采用方差分析及相关性分析。
2 结果
2.1 CD44v6及MMP-2在正常子宫内膜与异位、在位内膜组织中的表达 CD44v6在增生期子宫内膜的腺上皮细胞和腔面上皮细胞不表达，而在分泌期子宫内膜的腺上皮细胞和腔面上皮细胞表达，CD44v6阳性细胞的胞膜被染成棕黄色，胞浆内虽有CD44v6表达，但着色比胞膜浅。MMP-2阳性细胞胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒。正常内膜腺上皮与EMT在位内膜相比CD44v6、MMP-2表达差异无显著性 （P>0.05），而EMT异位内膜腺上皮CD44v6、MMP-2表达显著高于同组患者的在位内膜（P<0.01）。见表2。
表2 内膜腺上皮CD44v6及MMP-2的表达 （略）
注:与在位内膜相比， * P<0.01;与正常内膜相比， ** P>0.05
2.2 异位内膜组织中CD44v6的表达与MMP-2表达的关系 异位内膜组织中CD44v6与MMP-2的表达，二者之间χ 2 =14.2，P=0.001。CD44v6与MMP-2之间有高度的相关性，见表3。
表3 异位内膜组织中CD44v6与MMP-2表达的相关性 （略）
2.3 EMT患者血清及腹腔液中可溶性CD44v6及MMP-2的测定其值显著高于正常妇女，见表4。
表4 正常妇女和EMT患者血清及腹腔液中CD44v6及MMP-2的测定 （略）
注:单因素方差分析:CD44v6—1∶2P<0.05，3∶4P<0.01，1∶3P<0.05，2∶4P<0.01;MMP-2—1∶2P<0.05，3∶4P<0.05，1∶3P<0.01，2∶4P<0.01
2.4 EMT血清及腹腔液中可溶性CD44v6、MMP-2表达的相关性 见表5、表6。患者血清及腹腔液中所测值大于正常ˉx±3s为阳性。
表5 EMT患者血清中可溶性CD44v6与MMP-2表达的相关性 （略）
注:χ 2 =13.2，P<0.01，EMT血清中可溶性CD44v6与MMP-2表达有高度相关性
表6 EMT患者腹腔液中可溶性CD44v6与MMP-2表达的相关性 （略）
注:χ 2 =14.5，P<0.01，EMT腹腔液中可溶性CD44v6与MMP-2表达有高度相关性
3 讨论
3.1 CD44v6在EMT异位内膜组织异常表达的意义 EMT虽是良性病变，但EMT中子宫内膜腺上皮细胞的游走、黏附、种植与肿瘤细胞十分相似。黏附分子是由细胞合成的一类介导细胞与细胞、细胞与ECM黏附作用的膜表面糖蛋白，是维持机体正常生长发育、形体及组织器官正常结构与生命活动的一类重要分子。CD44v6属未分类的黏附分子，它是透明质酸的受体，介导细胞与基质的粘连 ［2］ 。CD44v6在多种人类上皮性肿瘤中的作用是近年研究的热点，EMT生物学行为与恶性肿瘤相似，研究CD44v6在EMT中发病机制中的作用有一定意义。
内膜腺上皮分泌期CD44v6高表达，增生期低表达 ［3］ ，EMT异位内膜腺上皮CD44v6表达显著高于其在位内膜，提示逆流经血中CD44v6表达阳性的细胞具有腹膜种植潜能，易与ECM黏附，进而种植浸润生长。本研究中，免疫组化显示CD44v6阳性细胞胞膜被染成棕黄色，胞浆内虽也有表达，但着色较细胞膜浅，反映出CD44v6主要定位于细胞膜，胞浆内较少。Thomas注意到与细胞外基质黏附作用由CD44v6蛋白的细胞外区决定 ［4］ ，可见细胞膜上CD44v6的表达对其与间皮细胞的黏附结合是至关重要的。CD44v6参与细胞的伪足形成 ［5］ ，影响细胞的迁移过程，CD44v6异常表达增加了异位内膜的游走性，CD44v6还参与淋巴细胞归巢、淋巴细胞活化及胞内信号传递过程，可引起异位病灶的转移。本研究还发现EMT患者血清、腹腔液中可溶性CD44v6表达显著高于正常妇女，提示异位内膜所要种植的外环境，也不同于正常妇女，且CD44v6在EMT患者腹腔液中水平［（252±52）ng/ml］显著高于血清中水平［（103±31）ng/ml］。由此可见，CD44v6的高表达，促进了异位内膜细胞异位种植生长的黏附环节，是子宫内膜细胞在盆、腹腔种植生长的重要因素，促进了EMT的发生发展。所以监测血清、腹腔液中可溶性CD44v6的水平可能成为EMT诊断、预后、疗效控制及复发判断的有效指标。而且，有学者证明［6］ ，用CD44v6受体球蛋白可以抑制远处转移，抗CD44v6抗体在体内和体外，都可以抑制转移的形成，这种抑制并非激活了某种免疫机制，而可能阻断了配体的作用。用抗CD44v6抗体抑制CD44v6功能可以抑制卵巢癌腹膜种植 ［7］ ，这一结果令人振奋，而在EMT治疗方面也有潜在的临床应用价值。
3.2 MMP-2在EMT中表达的意义 经血逆流是EMT发病的一个必要条件，但逆流入腹腔的内膜组织必须降解基底膜和其他的ECM成分才能植入腹膜 ［8］ ，使异位内膜能在卵巢、腹膜等处种植生长，而卵巢生发上皮特别活跃，距输卵管伞近，是EMT好发部位。异位内膜侵袭性增强使ECM降解和重建是EMT发病的关键环节。MMP-2可以降解Ⅳ 型胶原和明胶，具有调节细胞黏附的作用。Wenzl ［9］ 报道，异位内膜中MMP-2过度表达，能够降解异位内膜周围的基底膜及其他ECM成分，侵袭腹膜及病灶周围的结缔组织，使病灶种植、转移不断扩大，形成盆腹腔粘连，这也可能是EMT患者不孕或宫外孕发病率高的原因之一。本研究结果显示异位内膜组织中MMP-2高表达与正常子宫内膜组织比较差异有非常显著性（P<0.01），本研究中还发现，EMT患者血清、腹腔液中MMP-2水平显著高于正常妇女，且EMT患者腹腔液中的表达［（2342±131）μg/L］显著高于血清中水平［（1021±71）μg/L］（P<0.05），提示其来源可能主要为异位内膜细胞。腹腔液中MMP-2水平的升高为异位内膜的种植提供了有利环境。提示MMP-2在异位内膜侵袭机制上起一定作用。
3.3 CD44v6与MMP-2在EMT的发生发展中有协同作用 子宫内膜细胞要异位种植生长，必须具备黏附、侵袭和血管生成三个基本环节。黏附分子CD44v6表达的增加、易于与腹膜黏附而种植。内膜细胞侵袭必须降解ECM，而MMP-2可降解ECM和基底膜，还具有调节和维持肿瘤血管生长等作用，有研究发现，可能存在一条CD44介导的信号通路，这条通路可使MMP-2的表达上调，从而提高肿瘤细胞的移动和浸润能力 ［10］ 。在EMT的发生发展中CD44v6与MMP-2协同作用机制尚需深入研究。本研究结果显示:CD44v6与MMP-2的阳性表达之间有高度的相关性，提示二者在子宫内膜异位症的发生发展中的作用密切相关，这也为EMT的生物治疗提供了依据。
参考文献
1 Humphery PA，Wong AJ，Vogelstein B，et al.Amplification and expres-sion of EGFR in human glioma xenografts.Cancer Res，1998，48:2231.
2 Sy Ms，Liu D，Schiavone R，et al.Interactions between CD 44 and hy aluronic acid:their role in tumor growth and metastasis.Curr Top Micro-biol Immunol，1996，213（Pt3）:129-153.
3 Poncelet C，Leblanc M，Walker-Combrouze F，et al.Expression of cad-herons and CD 44 isforms in human endometrium and peritoneal en-dometriosis.Acta Obstet Gynecol Scand，2002，81（3）:195-203.
4 Thomas L，Byers HR，Vink J，et al.CD 44 H regulates tumor cell mi-gration on hyaluronate-coated substrate.J Cell Biol，1992，118（4）:971-977.
5 徐钊（综述），范维珂（审校）.CD44分子与消化道肿瘤转移和预后评估的研究进展.国外医学·临床生物化学与检验学分册，1998，19（3）:111.
6 Seiter S，Arch R，Reber S，et al.Prevention of tumor metastasis forma-tion by antivariant CD44v6.Exp Med，1994，177（2）:443-455.
7 Srobel T，Swanson L，Cannistra SA.In vivo inhibition of CD44limits in-tra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice:a novel for CD44in the process of pertoneal implantation.Cancer Res，1997，57:1228-1232.
8 Regidor PA，Vogel C，Regidodr M，et al.Expression pattern of intergrin adhesion molecules in endometriosis and human endometrium.Hum Re-po Update，1998，4（5）:710-718.
9 Wenzl RJ，Heinzl H.Localization of matrix metalloprotanase-2in u-terinc endometrium and ectopic implants.Gynecol Obstet Invest，1998，45（3）:253-257.
10 郭立霞，谢弘.CD44 与肿瘤转移.生命科学，2001，13（2）:61-63.
（编辑夏 露）
作者单位:276000山东省临沂市人民医院妇产科
250012山东大学齐鲁医院妇科（△ 通讯作者）