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【摘要】 卵母细胞的冷冻保存是在胚胎冷冻基础之上发展起来的另一项很有潜力的生殖技术。冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍。影响人卵母细胞冷冻的因素很多，主要是形态学和物理方面的因素。尽管现阶段卵母细胞冻贮的方法仍然以慢速冷冻法为主，但随着玻璃化技术的不断发展，玻璃化技术将成为人类卵母细胞冻贮的主要方法。
【关键词】 人类卵母细胞；冷冻保存
卵母细胞的冷冻保存是在胚胎冷冻基础之上发展起来的另一项很有潜力的生殖技术。尽管各国学者进行了大量的研究，但是相对于胚胎冷冻，整个卵子的冻存技术进展缓慢，卵母细胞冷冻保存效果还不理想，远未达到临床运用的程度，而冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍［1］。近年来随着冷冻技术的不断提高和ICSI技术的应用，卵母细胞冷冻效果也有了提高，现就人卵母细胞冻存的影响因素及冷冻现状做一综述。
1 卵母细胞冷冻原理及现状
卵母细胞的玻璃化冷冻原理与胚胎、精子及其他哺乳类动物细胞冷冻保存的原理基本相同，其实质是在降温的过程中细胞脱水，以尽量减少细胞内外冰晶的形成［2］。人们借鉴胚胎的冷冻方法，进行了大量的卵母细胞冷冻研究，建立了卵的低温冷冻方法，并迅速用于人卵的低温保存。1986年Chen［3］第一次报道了慢速程序冷冻人卵复温后体外受精并成功怀孕。1995年Hunter［4］报道玻璃化冷冻人卵获得了65%的存活率，45%的受精率，但都没有继续发育成活率，并将ICSI用于防止低温冷冻后卵的透明带硬化及多精受精。1999年Kuleshova［5］第一次报道了玻璃化技术冷冻人卵复苏后成功受孕,并顺利产下一健康婴儿。到目前全世界已有100多例冻卵复温后试管婴儿诞生［6］，但是卵母细胞冷冻保存的研究还未达到临床运用的水平。近年来随着玻璃化技术的发展，它也被用于卵的低温冻储，其基本原理是将冷冻保护剂的浓度提高，使冷冻时呈玻璃样状态，避免细胞外冰晶的形成，限制或明显减少细胞内的冰晶生成，减少冷冻损害。
2 影响人卵母细胞冷冻的因素
影响人卵母细胞冷冻的因素很多，主要是形态学和物理方面的因素。
2.1 形态学因素 所谓形态学因素最主要的就是卵母细胞的发育阶段，人类正常成熟卵母细胞是以卵冠丘复合体的形式存在，成熟卵母细胞处于减数分裂的MⅡ期，由于体积大，含水分多及染色体排列在纺锤体的赤道板上等原因，在冷冻复苏过程中极易受到细胞内冰晶形成所造成的损伤［7］ ，尤其是微管系统对热很敏感，在冷冻复苏过程中容易发生解聚［8］。处于减数分裂二期的卵母细胞对冷冻特别敏感，尽管温度恢复到正常，纺锤体重新组合，但是冷冻使非整倍体的发生率增加，因为染色体不可能在重新形成的纺锤体中完全正确排列［9］。温度降至低于正常体温7℃时，将发生不可逆的纺锤体变化，其原因可能是冷冻导致细胞骨架受到损伤，透明带硬化，精子穿透透明带能力下降，直接导致冻融后卵母细胞受精率降低。
相对于成熟卵母细胞，未成熟卵母细胞（GⅤ期）处于减数分裂的双线期，尚未形成纺锤体，而且体积小，染色体损伤的可能性小，冻存未成熟卵母细胞似乎是更好的选择［10］。已有研究证明未成熟卵母细胞冷冻复温后能够体外成熟，经IVF-ET已有婴儿出生。但有更多的报道认为未成熟卵母细胞对冷冻更敏感，冷冻损伤在GⅤ期还要较高，这可能是由于细胞膜的稳定性较低［11］，同时卵母细胞的体外成熟也是一个很大的难题。
2.2 物理因素 影响卵母细胞冷冻的物理因素主要指冷冻损伤。所谓冷冻损伤主要是由于细胞内外冰晶形成所造成的损伤，Byrd等［12］认为冷冻对细胞膜、细胞质及细胞连接均有损害。Boiso等［13］通过免疫染色观察微管和染色质发现，单纯暴露于冷冻保护液而未冷冻的卵母细胞，其第二次减数分裂的纺锤体结构不受影响，然而冷冻后，其纺锤体和染色体结构均受影响。通过计算机显微技术分析冷冻前和冷冻后的MⅡ期卵母细胞的纺锤体发现冷冻不可避免地造成纺锤体的损伤［14］。冷冻损伤主要包括物理损伤和化学损伤。物理损伤［15］主要是指细胞内结冰，体积增大，造成细胞膜性结构破坏。化学损伤又称为渗透性休克［16］，解冻时，细胞内通常所含的渗透性保护剂浓度很高，可达2000～3000mosm/L或更高，若将此时的细胞从冷藏管直接置于渗透压为300mosm/L的等渗盐溶液中，此时大量的水分快速进入细胞,而保护剂不能立即渗出，即引起细胞急剧肿胀甚至破裂，此种现象称为渗透性休克［9］。无论物理损伤还是化学损伤都可造成卵母细胞透明带硬化、破裂，细胞死亡甚至染色体损伤。Paynter等［17］认为通过慢速冷冻，几乎可以移走细胞内所有的水分。此外，复温的方法也是决定冷冻效果的一个重要因素，解冻太快和太慢都会损害细胞。解冻太快容易发生透明带破坏，所以从液氮中取出冷冻管后需要在空气中停留一定时间，但解冻太慢，就会形成细胞内冰晶，速度快慢之间的界限很窄，细胞内冰晶重新形成开始于－85℃～－70℃。所以，把冷冻管在空气中复温到接近－80℃时，换成快速升温法，即将冷冻管置于30℃水浴中复温。
3 展望
综上所述，尽管现阶段卵母细胞冻贮的方法仍然以慢速冷冻法为主，但因为玻璃化技术具有缩短冷冻处理所需时间，简化冻存操作步骤，不需要昂贵的程序式降温仪和理想的卵母细胞存活率、受精率［5］等优点，玻璃化技术具有良好的发展前景，随着渗透性高、毒性小的玻璃化液的出现，玻璃化技术将成为人类卵母细胞冻贮的主要方法。
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作者单位：1 404000 重庆，重庆三峡中心医院妇产科
2 400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院泌尿外科
(编辑：江 枫)