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【摘要】 目的 探讨端粒酶定量检测在上皮性卵巢癌诊断中的临床意义。方法 以20例上皮性卵巢癌患者为研究对象，行实时定量端粒重复扩增PCR法（RTQ-PCR）定量检测患者肿瘤组织中的端粒酶活性。结果 上皮性卵巢癌患者临床Ⅰ～Ⅱ期的端粒酶值（197.10±28.20）与临床Ⅲ～Ⅳ期（347.14±60.10）相比，结果表明端粒酶活性与临床分期具有相关性，P<0.05；而与肿瘤组织学分类无关，P>0.05。结论 端粒酶定量检测有助于卵巢癌早期诊断及预后监测。
【关键词】 端粒酶；卵巢癌；实时定量端粒重复扩增PCR法
端粒是真核细胞染色体末端的特殊的核蛋白结构，它能起到稳定染色体的作用。随着细胞分裂，端粒会逐步缩短到临界水平，细胞老化并丧失繁殖能力而死亡。因此，端粒为细胞有丝分裂的“生物钟”。端粒酶是一种核糖核蛋白，能以自身RNA为模板逆转录合成端粒DNA的重复序列，从而维持端粒长度的稳定，故端粒酶与细胞永生化及细胞无限增殖密切相关。它与多种恶性肿瘤的发生、发展有关，在妇科肿瘤的卵巢癌中检测到的活性较强，目前认为它可能是最为广泛的肿瘤分子标志物，故其成为肿瘤诊治领域中的热门课题之一。本文采用实时定量端粒重复扩增PCR法（RTQ-PCR）检测了20例上皮性卵巢癌组织中端粒酶主体成分hTR（human telomerase-associated RNA)值的高低，并探讨其与上皮性卵巢癌的临床分期及病理类型的关系，揭示其在卵巢癌诊治中的价值。
1 材料与方法
1.1 材料 20例上皮性卵巢癌组织均取自我院2002年3月～2004年2月的妇科住院患者的手术标本。所有患者均由术后病理组织检查确诊。病理类型包括浆液性囊腺癌9例、黏液性囊腺癌11例。临床分期按FIGO标准（1998年），其中Ⅰ、Ⅱ期8例；Ⅲ、Ⅳ期12例。
1.2 方法
1.2.1 标本与试剂 采用Roche公司的LightCycler Telo TAGGG hTR Quantification Kit试剂盒。采用LightCycler仪器操作。所有标本均在手术中无菌采集后于0.5h内置于液氮冻存待测。
1.2.2 方法 RNA抽提：取5mm直径组织块，采用Trazol试剂（上海申能博彩公司）抽提总RNA。核酸蛋白检测仪检测RNA浓度。RNA逆转录为cDNA，并同时进行扩增及管家基因PBGD酶（胆色素源脱氨酶）的检测操作步骤严格按照试剂盒说明进行。于微量离心管中加入反应液18μl，hTR模板2μl，逆转录酶0.1μl,PBGD酶探针混合物2μl，于60℃放置10min，95℃放置30min，随后进行扩增：95℃放置10min，60℃放置10min，72℃放置10min,共进行45个循环，最后40℃放置60min冷却。根据测得的数值按照公式（+RT）-（-RT）/PBGD值，结果为端粒酶定量所得的值。本文20例上皮性卵巢癌标本均测得端粒酶活性。
1.2.3 结果分析 采用SPSS 10.0统计软件进行t检验。
2 结果
2.1 端粒酶活性与上皮性卵巢癌临床分期的关系 见表1。
表1 端粒酶活性与卵巢癌临床分期的关系 （略）
由表1可见端粒酶活性随着卵巢癌的期别增加而增强，Ⅲ～Ⅳ期的患者高于Ⅰ～Ⅱ期的患者（P<0.05）。
2.2 端粒酶活性与上皮性卵巢癌的组织学分类的关系 见表2。
表2 端粒酶活性与卵巢癌组织分类的关系 （略）
表2可见端粒酶活性与上皮性卵巢癌的组织学分类无明显关系（P>0.05)。
3 讨论
1989年，Morin等首次在宫颈癌细胞中检测到了端粒酶活性，并逐步证实了端粒酶是由RNA单链和结合的蛋白成分共同组成的复合体，属于一种专一依赖RNA的逆转录酶。细胞要获得永久生化必须克服两个危机期，即M1期和M2期。恶性肿瘤细胞可通过激活端粒酶，使端粒酶长度得以维持，染色体形态稳定，使细胞越过M1及M2期而成为永生化细胞。许多研究表明端粒酶的激活参与了卵巢癌早期发生，故检测端粒酶活性在卵巢癌诊断中有重要意义。Park等［1］检测了37例卵巢肿瘤端粒酶活性差异、端粒酶催化亚基与RNA表达水平时发现端粒酶催化亚基（hTERT）、hTR均与端粒酶活性增高有关。以TRAP法检测端粒酶活性，发现16例卵巢癌中13例阳性；10例LMP中9例阳性，11例良性肿瘤中3例阳性，以PT-PCR法检测端粒酶hTERT mRNA表达，卵巢癌中14例阳性，LMP中8例阳性，良性肿瘤中4例阳性。证实端粒酶阳性可作为卵巢癌有价值的诊断指标。
hTR为人类端粒酶RNA，是端粒酶的主体结构，能逆转录合成人端粒TTAGGG重复结构。依据这一特性，本研究定量检测了卵巢肿瘤中的端粒酶含量，此项为PCR定量杂交技术，在PCR反应体系中引入了竞争性的DNA内对照DNA-IS。因此，标本和DNA-IS的比值反映了起始混合物的浓度比值，具有高度特异性。较之以往的PCR定性检测敏感性好，且更为直观和精确［2］。本文结果显示卵巢肿瘤的分化程度越差，端粒酶表达的数值越高；Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期的表达。这与Kyo等［3］的研究结果一致。因此检测其含量可以对判定卵巢肿瘤的期别及病理类型提供帮助。此外，有学者研究利用2-5A反义核苷酸对HEY-1B卵巢癌性细胞系直接封闭hTR后，引起端粒酶活性下降，并诱导细胞凋亡［4］，为卵巢癌的治疗提供了方向。
卵巢癌起病隐匿、进展迅速的特点使其成为死亡率最高的妇科恶性肿瘤。70%的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存率低于30%，而早期卵巢癌患者的生存率可达90%，故提高早期诊断水平能够改善患者的预后。随着对端粒酶在卵巢癌发生、发展中的机制的研究不断深入，卵巢癌的早期发现及早期诊断水平将不断提高，并为卵巢癌的治疗提供研究方向。
【参考文献】
1 Park TW,Riethdorf S,Riethdorf L,et al.Differential telomerase activity,expression of the telomerase catalytic sub-unit and telomerase-RNA in ovarian tumors.Int J Cancer,1999,84(4):426-431.
2 Mark Schrader ,Markus Müller,Rùdiger Heicappell,et al.Human telomerase RNA (hTR) and human telomerase reverse transcriptase quantification of (hTERT)mRNA in testicular tissue of infertile patients.Asian J Androl,2001,3:263-270.
3 Kyo S,Takakura M,Tanaka M,et al.Quantitative differences in telomerase activity among malignant,premalignant,and benign ovarian lesions.Clin Cancer Res,1998,4(2):399-405.
4 Kushner DM,Paranjape JM,Bandyopadhyay B,et al.2-5A antisense directed against telomerase RNA produces apoptosis in ovarian cancer cells.Gynecol Oncol,2000,76(2):183-192.
(编辑：宋 青)
作者单位： 213003 江苏常州，常州市第一人民医院妇科
江苏苏州，苏州大学第一附属医院妇产科