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【摘要】 目的 评价采用激光辅助孵化是否会提高高龄妇女体外授精-胚胎移植的妊娠结局。方法 回顾性分析了75例高龄妇女（≥38岁）79个体外授精-胚胎移植周期的临床妊娠率和胚胎植入率，其中38个周期在胚胎移植前采用激光薄化处理透明带，41个周期没有进行处理（对照）。结果 在胚胎移植前采用激光辅助薄化处理透明带，能显著提高移植周期的临床妊娠率（36.84% vs 17.07%，P＜0.05）和胚胎植入率（15.18% vs 6.92%，P＜0.05）。结论 采用激光薄化处理胚胎透明带能有效提高胚胎的种植能力。
【关键词】 人类胚胎；激光；辅助孵化
Effects of assisted hatching on pregnancy outcome of advanced age women following in vitro fertilization-embryo transfer
HUANG Ping，LIU Wei-xin，WANG Li，et al.Chengdu Institute of Family Planning，Chengdu 610031，China
［Abstract］ Objective To evaluate the effects of laser-assisted hatching on pregnancy outcome following in vitro fertilization treatment.Methods We retrospectively analyzed the pregnancy rate and implantation rate of 75 advanced age women （＞38 years），79 IVF-ET cycles including 38 cycles of which zona pellucida were thinned by laser and 41 cycles as control.Results Zona pellucida thinning by laser before human embryo transfer significantly increased the clinical pregnancy rate （36.84% versus 17.07%） and implantation rate （15.18% versus 6.92%） compared with control group.Conclusion The implantation potential of advantaged age women can be improved by laser-assisted hatching following in vitro fertilization treatment.
［Key words］ human embryo;laser;assisted hatching
在体外授精-胚胎移植（IVF-ET）过程中，胚胎种植率较低一直阻碍着辅助生育技术的发展，囊胚扩张后透明带不能破裂导致胚胎孵出困难是胚胎种植失败的原因之一［1］。体外培养和胚胎冷冻过程可能会导致透明带硬化，从而影响囊胚的孵出和种植［2］。辅助孵化（assisted hatching，AH）是将胚胎透明带进行处理，帮助胚胎从透明带中孵出的技术。有研究报道辅助孵化能有效提高高龄妇女和IVF失败妇女IVF-ET的成功率［3，4］。然而，也有研究认为辅助孵化不会提高高龄妇女体外受精的成功率［4，5］。尽管进行辅助孵化诞生的试管婴儿数量在不断增加，但对辅助孵化是否有明显效果还尚有争论。目前用于辅助孵化的技术有机械、化学、酶、激光等方法。但是无论采取何种方法在透明带上打孔均有可能导致囊胚孵出困难和单卵双胎率增加［6］。Palmstierna等研究认为，透明带变化率大的胚胎种植率明显提高，于是尝试使透明带部分区域变薄来帮助囊胚扩张孵出［7］。本文回顾性分析激光透明带部分薄化处理对高龄妇女体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2001年1月～2005年12月，在成都市计划生育技术指导所生殖医学中心75例38岁以上患者进行体外受精-胚胎移植79个周期。所有患者随机分成2组，Ⅰ组包括38个周期（37例患者），采用激光辅助薄化胚胎透明带；Ⅱ组（对照组）包括41个周期（38例患者）没有进行辅助孵化。
1.2 控制性超促排卵和体外授精 患者用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a，Serono，Switzerland）和人绝经期促性腺激素（hMG，Pergonal，Serono），采用长方案或短方案进行超促排。当发现3个或以上主导卵泡直径达16～18 mm时，注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，Profasi，Serono）。注射HCG 36～38 h后，阴道B超引导下穿刺卵泡采集卵母细胞。IVF和ICSI过程采用常规方法［8］。
1.3 激光辅助孵化 胚胎移植当天，用计算机控制的1.48 mm波长的二极管激光器（OCTAX Laser ShotTM System，Germany）。二极管激光器连接在Nikon TE 300倒置显微镜的物镜下［9］。胚胎透明带薄化采用照射时间为12 ms的激光围绕透明带外缘做连续不超过6次的照射，在透明带上产生一个长约80 μm，厚约透明带总厚度的50%～80%的薄化区［6］。胚胎用HTF液洗涤数次，并转入37 ℃、5% CO2培养箱中培养直到移植。
1.4 胚胎移植、临床妊娠和胚胎植入率 根据Steer等［10］报道的评分标准进行胚胎分级，只有Ⅰ～Ⅱ级胚胎才用于胚胎移植和冷冻。胚胎移植在取卵后第3天用KJET-3005（COOK，Australia）移植管进行。不超过3个胚胎移植入子宫内。用孕激素、雌激素或HCG进行黄体支持。移植后2周检测β-HCG，当连续两次（间隔2天）测定β-HCG水平升高，则可以认为生化妊娠。胚胎移植后4周B超检查是否有孕囊和胎心确定是否临床妊娠。胚胎植入率是B超下所见孕囊数占移植胚胎数的比率。
1.5 统计学方法 采用SPSS软件对数据进行处理，行t检验和χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
从本组研究可以看出，激光辅助孵化组与对照组间在夫妻双方年龄、取卵数、受精率、卵裂率、胚胎移植数方面差异没有统计学意义（P＞0.05）。然而采用激光辅助薄化胚胎透明带后，胚胎植入率和临床妊娠率显著高于没有进行辅助孵化者（P＜0.05）。见表1。 表1 激光辅助孵化对IVF-ET妊娠结局的影响
3 讨论
透明带具有包绕卵母细胞和胚胎的无细胞结构，在卵母细胞受精时促进精卵结合并阻止多精受精，在种植前阶段保护胚胎细胞免受病菌及免疫细胞侵害并维持其三维结构完整性的功能。胚胎在体外培养过程中，培养基、培养时间延长会导致透明带硬化。辅助孵化通过在透明带上打孔或薄化透明带，可克服由于透明带变厚变硬而造成的机械障碍，减少活力不足胚胎孵出时的能量需要；同时与生理周期相比，接受卵巢刺激的患者种植窗提前，而体外培养胚胎发育落后于体内培养胚胎，辅助孵化允许胚胎较早孵出，在种植窗关闭前种植［1］。
目前胚胎辅助孵化可以采用机械、化学、激光等技术进行。Cohen等1992年报道，用酸辅助孵化胚胎能提高种植率［2］。Mansour等研究发现，在移植前用Tyrode酸将透明带完全去除，可显著提高妊娠预后不良患者的妊娠率［11］。激光为胚胎辅助孵化提供了一种简便、快速、安全的途径。Hsieh等的临床研究表明，激光法在提高高龄妇女妊娠率上优于化学法［12］。Antinoril等报道，激光辅助孵化能有效提高IVF-ET预后不良患者胚胎移植的临床妊娠率和胚胎种植率［13］。Balaban等2006年报道，激光辅助孵化能有效提高人类冷冻胚胎移植的临床妊娠率和胚胎种植率［14］。然而，Balaban等2002年则认为对于经选择的患者，采用机械法、化学法、激光法和酶消化法四种辅助孵化方法对胚胎种植率和临床妊娠率没有显著影响［15］。同时，也有研究认为激光辅助孵化不能提高人类冷冻胚胎的种植潜力［16］。
无论采取何种方法在透明带上打孔均有可能导致囊胚孵出困难合单卵双胎率增加，同时打孔后病菌与抗原可能侵害胚胎［7］。研究者认为透明带变化率大的胚胎种植率明显提高，于是尝试使用透明带薄化处理来帮助囊胚扩张孵出。采用激光对胚胎进薄化处理发现，胚胎发生了自然薄化，囊胚孵出率明显高于未处理组［6］。很多研究者认为辅助孵化能有效提高高龄妇女（≥38岁）、冷冻胚胎移植、卵巢反应差、IVF失败（≥2次）透明带较厚妇女IVF-ET的成功率。然而，也有研究认为辅助孵化不会提高高龄妇女体外受精的成功率［5，17］。该回顾性分析表明，在女方年龄、男方年龄、取卵数、受精率、卵裂率、移植胚胎数没有显著性差异的条件下，在胚胎移植前，采用激光薄化处理胚胎透明带的胚胎植入率和临床妊娠率得到了显著提高（表1）。
实验证明了采用激光辅助薄化处理胚胎透明带对提高临床高龄妇女胚胎移植的临床妊娠率和胚胎植入率有显著影响。而且激光辅助薄化技术操作快速、方便、可控制、对胚胎的影响小，因此在临床中可以作为辅助孵化的一种有效方式。
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作者单位：610031 四川成都，成都市计划生育技术指导所