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【摘要】 目的 检测胎盘组织中Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)及转录因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)的表达,探讨其与妊娠期高血压疾病发病的关系。方法 用免疫组化法对40例妊娠期高血压疾病患者(试验组)(妊娠期高血压10例、子痫前期30例)、20例正常妊娠孕妇(对照组)胎盘组织中TLR4及NF-κB进行检测。结果 子痫前期(preeclampsia,PE)患者胎盘中的TLR 4及NF-κB表达明显高于正常妊娠组(P<0.05)。结论 胎盘组织中的TLR4及NF-κB表达升高与妊娠期高血压疾病的发病有关。
【关键词】 Toll样受体4;转录因子-κB;妊娠期高血压疾病
Expression of Toll-like receptor and NF-κB in the placenta of patients with hypertensive disorder complicating pregnancy
WANG Jun. Ningbo Women and Children’s Hospital，Ningbo 315012，China
Objective To detect Toll-like receptor 4 and NF-κB in the placenta in order to evaluate the relationship of Toll-like receptor 4 and NF-κB with hypertensive disorder complicating pregnancy.Methods The expression of Toll-like receptor 4 and NF-κB in 20 normal pregnant women(the control group )and 40 hypertensive pregnant women(the study group)，encluding 10 patients with gestational hypertension and 30 patients with preeelampsia placenta was detected by immunohistochemistry.Results The Toll-like receptor 4 and NF-κB expression levels in PE group were all significantly higher than those in normal pregnant group (P<0.05).Conclusion The elevated expression of Toll-like receptor 4 and NF-κB in the placentamay play an important role in PE.
[Key words] Toll-like receptor 4; nuclear factor-kappa B; hypertensive disorder complicating pregnancy
妊娠期高血压疾病是影响母儿围生期病率和死亡率重要原因之一，妊娠期高血压疾病的病因及发病机制至今未完全阐明。近年来研究发现妊娠期高血压疾病与炎性细胞因子有关，而Toll样受体(toll like receptors，TRLs)是联系固有免疫与适应性免疫的纽带，是激活相关细胞的NF-κB分泌炎症介质的闸门受体,其中TLR4在这个过程中起着关键的作用[1] 。本文旨在探讨妊娠期高血压疾病胎盘组织中TLR4和NF-κB的表达及意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象 选择2006年6月-2007年6月在我院住院分娩的妊娠期高血压疾病患者40例,其中妊娠期高血压10例,子痫前期轻度15例,重度15例。平均年龄(27.9±3.2)岁,平均孕周为(268.3±24.0)天。妊娠期高血压疾病的诊断及分类标准参照乐杰主编《妇产科学》第7版为标准。随机选取同期住院分娩的健康足月孕妇20例为对照组,平均年龄(28.8±1.7)岁,平均孕周为(276.5±5.9)天。各组均无其他产科并发症及妊娠合并症。两组孕妇年龄及孕周比较,差异无显著性(P>0.05)。
1.2 方法 胎盘娩出后,立即取胎盘母体面中央绒毛组织约1.0cm×1.0cm×1.0cm大小、无钙化的胎盘组织。用生理盐水冲掉血液,然后置于4%的多聚甲醛中固定24h,低温石蜡包埋,4μm连续切片,进行免疫组织化学染色(SABC法)。
1.3 试剂 TLR4及NF-κB免疫组化染色试剂盒及DAB染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司,具体操作方法严格按说明书进行。
1.4 结果判定 TLR4及NF-κB以镜下在细胞胞浆出现棕黄色颗粒, 用乳腺癌阳性片做阳性对照，PBS液代替一抗做阴性对照。由两个观察者对切片进行盲式阅片,显微镜下随机选择5个视野,观察所选择的高倍镜视野中的所有滋养细胞,记录阳性染色细胞百分数(%)并计分。阴性：小于5%的胎盘细胞呈阳性或无着色,计0分;弱阳性：5%～10%的胎盘细胞呈阳性,计1分;阳性：11%～50%胎盘细胞呈阳性,计2分;强阳性：大于50%的胎盘细胞呈阳性,计3分。细胞着色强度则以阳性细胞呈现的染色(棕黄色)计分：强着色：着色和已知阳性片同样强度,计3分;浅着色：着色浅,但与阴性对照片有明显区别者，计1分;染色强度在浅着色和强着色之间者为中等着色,计2分;将阳性百分数计分和细胞染色计分相加为免疫组化积分。
1.5 统计学分析 实验数据以均数±标准差表示,分析所有数据输入计算机,用SPSS 11.0统计学软件进行处理。对数据进行正态性检验和方差齐性分析后。临床资料采用t检验P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 TLR4及NF-κB在各组胎盘组织中的表达 在正常妊娠组及妊娠期高血压疾病组的胎盘组织中均有一定表达，正常妊娠胎盘组织中的TLR4及NF-κB的阳性染色主要位于合体滋养细胞(见图1及图2); TLR4及NF-κB在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的表达定位与正常妊娠晚期胎盘组织的表达定位相同(见图3及图4),但在子痫前期轻度、子痫前期重度组与正常妊娠组比较,胎盘组织NF-κB含量逐渐升高，见表1。
2.2 各组胎盘滋养细胞TLR4及TLR4表达的免疫组化积分 见表1。子痫前期轻度组、子痫前期重度组与正常晚期妊娠组比较,差异有显著性(P<0.05)。
3 讨论
妊娠期高血压疾病是妊娠特有的疾病。妊娠是一种成功的半同种移植现象,其成功有赖于母胎间免疫平衡。大量研究显示,妊娠期高血压疾病的发生与免疫系统的变化关系密切,妊娠期间非特异性免疫功能增强,非特异性免疫是通过炎性细胞因子发挥作用的。Medzhitov等[2]研究发现妊娠期间非特异性免疫反应过度激活可引起PE, PE患者体内存在某种因素激活单核-巨噬细胞,将造成炎性细胞因子的大量释放, 异常的滋养细胞的侵入，损伤血管内皮细胞及肾损害等，研究表明TLR4在这个过程中起着关键的作用。
Toll样受体是参与固有免疫的一类古老的蛋白质家族,TLRs在细胞信号转导中发挥重要的作用,是激活相关细胞分泌炎症介质的闸门受体,是联系固有免疫与适应性免疫的纽带。1997年Medzhitov等[3]发现了第一个存在于人细胞表面的Toll样蛋白,称Toll样受体。目前在人体内已发现10余个Toll样受体家族成员,其中与内毒素信号传导有关的主要为TLR4。TLR4启动的胞内信号转导最终激活NF-κB,诱导单核-巨噬细胞产生前炎性细胞因子，如IL-1b、IL-6、 TNF-α等。尽管PE的发病机制不清,但胎盘来源的炎症性细胞因子导致了PE的血管内皮细胞的损伤,这一结论已经得到公认。Holmlund等[4]对正常足月妊娠胎盘免疫组化研究,证明其中有TLR4的表达。Abrahams等[5]提出TLRs在介导母胎之间天然免疫中起重要作用。2005年Kim等[6]用免疫组化法研究了胎盘中的TLR4的结果相似，这一结果证实了TLR4与PE关系密切。
本研究采用免疫组化法检测妊娠期高血压疾病患者和正常妊娠晚期妇女胎盘组织中TLR4及NF-κB蛋白表达情况,结果提示TLR4及 NF-κB在PE胎盘组织合体滋养细胞中表达与正常胎盘组织相比明显升高，且随疾病的进展，表达渐增高，而妊娠期高血压患者比较虽有增高，但无统计学意义。这一结果证实了TLR4与PE的关系，可见作为引发PE的关键部位,胎盘组织中TLR4表达的变化可能PE发生的关键环节之一，并影响疾病的发展。从这一结果推测可能存在某些内源性因素刺激胎盘组织TLR4，进而激活NF-κB,引发TNF-α、IL-6的释放,表明PE时胎盘组织中TLR4表达与IL-6、TNF-α分泌之间可能存在相关性,但激活TLR4的这些内源性因素及TLR4和炎性细胞因子之间的相关性有待深入研究。
综上所述, PE患者胎盘中TLR4及NF-κB表达增加可能是PE发病机制中的关键环节之一,寻找TLR4的内源性配体是探讨子痫间前期发病机制的重要内容之一,为我们进一步探讨天然免疫对PE的影响提出新课题。
【参考文献】
1 Visser N, vanRijn BB, Rijkers GT, et al. Inflammatory changes in preeclampsia: current understanding of the maternal innate and adaptive immune response. Obstet Gynecol Surv, 2007,62(3): 191-201.
2 Medzhitov R, Janeway CA.Decoding the patterns of selfand non-self by the innate immune system. Science, 2002, 296(5566): 298-300.
3 Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA. A human homo-logue of the drosophila Toll protein signals activation of adaptiveimmunity. Nature, 1997, 388(6640): 394-397.
4 Holmlund U, Cebers G, Dahlfors AR, et al. Expression and reg-ulation of the pattern recognition receptors Toll-like receptor-2 and Toll-like receptor-4 in the human placenta. Immunology,2002, 107(1): 145-151.
5 Abrahams VM,Mor G. Toll-like receptors and their role in thetrophoblast. Placenta, 2005, 26(7): 540-547.
6 Kim YM, Romero R, Oh SY, et al. Toll-like receptor 4: a po-tential link between“danger signals”, the innate immune sys-tem, and preeclampsia?Am J Obstet Gyneco,2005,193:921-927.