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【摘要】 目的 观察四氧嘧啶致糖尿病大耳白兔的胆石形成情况和胆囊胆汁脂质成分变化，探讨糖尿病胆石形成的机理。方法 选择家兔48只，随机分为正常（N）组、四氧嘧啶致糖尿病（DM）组、高胆固醇饲养（CH）组、糖尿病加高胆固醇饲养（DMCH）组。饲养6周后处死观察胆囊结石形成情况，测定胆囊胆汁中胆汁酸、磷酸、胆固醇，观察胆囊超微结构的变化以及糖尿病模型的胰腺病理改。结果 N组无一例成石，DM组和CH组皆12/12成石，CMCH组10/12成石。胆囊胆汁成分分析中，DM组、CH组和DMCH组总胆汁酸（mmol/L）分别为77.53±11.93、51.81±8.12和53.27±7.04，N组为79.28±18.28;与N组比较结合胆汁酸减少（以DM组最明显），其中甘氨胆汁酸盐与牛磺胆汁酸盐均减少;鹅去氧胆酸减少，胆酸/鹅去氧胆酸比值升高;胆汁胆固醇（mmol/L）分别为5.31±0.81、5.69.20和5.12±1.47，N组为0.86±0.20;磷脂（mmol/L）分别为0.35±0.16、0.52±0.18和1.38±0.34。DM组胆囊存在糖尿病微血管病变，CH组胆囊有脂质浸润;DMCH组二者均存在。结论 证实四氧嘧啶致糖尿病大耳白兔胆囊结石形成率甚高，胆囊胆汁酸（尤其是结合胆汁酸）分泌减少、磷脂减少和胆固醇增加形成成石胆汁，以及形成胆囊微血管病变是胆石形成的重要因素，为深入研究提供了有用的工具。
关键词 大耳白兔糖尿病模型 胆石症 胆汁脂质 胆囊微血管病变
To build the cholelithiasis model in rabbits with DM and research the pathogenesis of cholelithiasis
Li Fangru，Cao Zewei，Li Xiaohua，et al.
Nankai Hospital，Tianjin300100.
【Abstract】 Objective To observe the condition of gallstone of rabbits with DM induced by Alloxan，and research the pathogenesis of cholelithiasis.Methods 48rabbits were randomly divided into4groups，there are12per group:the group N，as normal control;the group DM，with diabites induced by Alloxan;the group CH，fed by high concentration of cholesterol;the group DMCH，with diabetes induced by Alloxan and fed by high concentration of cholesterol.Killed at the end of the6 th weeks of fedding，the condition of stone formation in the gallbladder was observed.The bile acid，phosphoˉlipid and cholesterol in the bile of gallbladder were analyzed by chromatograph of liquid and the gallbladder was examined by both light and electron icroscope.Results At the end of the6 th week，none of the group N had gallstone.Stones were seen in the gallbladder of12/12cases in either group DM and CH，and11/12in the group DMCH.The mean conˉcentrations（mmol/L）of the total bile acid in the gallbladders were respectively77.53±11.93，51.81±8.12and53.27±7.04in group DM，CH and DMCH，but it was79.28±18.28in group N.Combined bile acids（both glycocholic acid and taurocholic acid）were apparently lessened and the ratio of cholic acid and chenodeoxycholic acid was rised in group DM，CH and DMCH，the concentrations（mmol/L）of cholesterol were respectively5.31±0.81，5.69±2.20and5.12±1.47，but0.86±0.20，in the group N;those of phospholipd were respectively0.35±0.16，0.52±0.18and1.38±0.34，but0.59±0.28，group N.There exist diabetic angiopathy in the cholecysts of group DM.There was lipid soakage in the gallbladder of group CH.Both diabectic angiopathy and lipid soakage are presented in group DMCH.Conclusion It was confirmed that there was rather high rate of cholecysts stone forming in the rabbits with DM led by Alloxan，that the bile acid，phospholipid reduced and cholesterol increased in the
bile of gallbladder and there exist diabetic angiopathy in the cholecysts are all the risk factors.
Key words diabetes mellitus cholelithiasis bile lipid metabolize diabetic angiopathy
近年，越来越多的临床和尸检报告证实，糖尿病患者胆石症发病率增加，约为25%～30%。但是对发病率增加的机理研究报道甚少 ［1］ 。天津市南开医院消化内科在人体研究的基础上，于1997～2001年对四氧嘧啶诱导的糖尿病兔模型进行研究，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组和处理 北京成年大耳白兔48 只，雌雄各半。体重2.8～3.9kg，由天津实验动物中心提供。购入后按体重编号，随机分为4组。（1）正常对照组（N组）:入组12只，终末存活12只。常规饲料喂养，自由饮水;（2）糖尿病组（DM组）:14只入组，终末存活11只。常规饲料喂养，自由饮水，1周后禁食24h，将新配制的四氧嘧啶（购自美国Sigma公司）按140mg/kg由耳缘静脉30s内注入，2h后饲以50%葡萄糖，48h后经耳缘静脉取血验血糖，超过11.1mmol/L者为糖尿病模型成功，以后根据血糖情况适当皮下注射精蛋白锌胰岛素，使血糖控制在20mmol/L左右;（3）高胆固醇饲料组（CH组）:入组12只，终末存活11只，常规饲料喂养1周后，以常规饲料内添加1%胆固醇（购自军事医学科学院天津市东卫卫生材料厂分装进口品）喂养4周，然后，再给予常规饲料内添加3%胆固醇及0.5%二氢胆固醇喂养2周;（4）糖尿病高胆固醇饲料组（DMCH组）:入组16只，终末存活11只。制成糖尿病2周后按高胆固醇饲料组方法喂养，糖尿病的处理方法同糖尿病组。实验结束后，禁食4h，先经耳缘静脉取血4ml，然后断头处死，沿腹中线开腹，结扎胆总管后完整摘取胆囊（确保胆汁不外漏）、肝脏和胰腺。
1.2 实验项目 在离体胆囊底部以注射器抽取全部胆汁，注入过滤器，观察过滤膜上结石沉积情况。以日本岛津LC-6A高效液相色谱分析仪对胆汁滤液进行胆固醇、磷脂和胆汁酸分析;胆酸、牛黄胆酸、 甘氨胆酸、鹅去氧胆酸、牛黄鹅去氧胆酸、甘氨鹅去 氧胆酸、去氧胆酸、牛黄去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、熊去氧胆酸、牛黄熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、胆固醇，卵磷脂等标准品购自美国Sigma公司。部分胆囊、胰腺以10%福尔马林固定送光镜检查，另一部分投入2.5%戊二醛多聚甲醛液中固定，再以1%四氧化锇酸后固定，包埋后以LKB=D型超切机进行超切片，醋酸银及柠檬铅染色，在Jeol-Tem-100CX投射电子显微镜下观察细胞超微结构。
1.3 统计学方法 采用SPSS10.0进行统计学处理。
2 结果
2.1 各组动物体重和血糖情况 见表1。
表1 各组动物体重和血糖情况 （略）
2.2 各组动物胆囊结石情况 各组结石经鉴定皆为胆固醇结石。形成例数见表2。
表2 各组动物胆囊结石情况
2.3 各组动物血脂水平 见表3。
2.4 各组动物胆囊胆汁总胆汁酸、磷脂和胆固醇浓度 见表4。
2.5 各组动物胆囊胆汁各种胆汁酸浓度 见表5。
表3 各组动物血脂水平 （略）
注: * P<0.05， ** P<0.01
2.6 胆囊和胰腺病理及超微结构 两组糖尿病动物胰腺可见萎缩，胰岛细胞数目减少，细胞变性，部分细胞胞浆呈空泡状，细胞间可见淀粉样物。两组非糖尿病动物胰腺未见异常。电子显微镜检查发现，胆囊上皮细胞内外可见脂肪泡，平滑肌凋亡，微血管内皮细胞基膜明显增厚，甚至断裂，坏死。
3 讨论
3.1 关于糖尿病引起胆石症的动物模型 糖尿病动物模型的制作有多种，包括:手术、化学药物损伤、病毒感染、胰岛素拮抗因子、催肥;转基因动物以及自发性糖尿病动物等 ［2］ 。但这些动物是否引起胆石症尚未见报道。本实验以四氧嘧啶诱导大耳白兔糖尿病成功后，以少量胰岛素治疗维持血糖在20mmol/L，无论是普通饲料还是高胆固醇饲料喂养6周后，皆可使之大部分有胆囊结石形成。鉴于糖尿病和胆 石症形成率皆高，易饲养，价格便宜，因此为糖尿病 诱发胆石症的进一步研究提供了有力的工具。
3.2 不同情况下大耳白兔胆囊胆汁成分的改变
3.2.1 正常大耳白兔胆囊胆汁成分的特点 总胆汁酸38.32mg%（相当79.28mmol/L），初级胆汁酸中，鹅去氧胆酸明显占优势，胆酸:鹅去氧胆酸约为0.28。次级胆汁酸中未查见熊去氧胆酸，而去氧胆酸4.47mg%。胆囊胆汁中胆固醇（0.86±0.20）mmol/L，磷脂（0.59±0.28）mmol/L。
3.2.2 糖尿病大耳白兔胆囊胆汁成分的特点 总胆汁酸虽有下降，但与正常差异无显著性;鹅去氧胆酸明显减少，但胆酸明显增加胆囊胆汁中胆固醇明显增加至（5.31±0.81）mmol/L，磷脂减少至（0.35±0.16）mmol/L。根据Small三角 ［3］ ，显然已是成石胆汁。
3.2.3 高胆固醇饲养大耳白兔胆囊胆汁成分的特点 总胆汁酸明显低于正常，鹅去氧胆酸明显减少，但胆酸增加不明显。胆囊胆汁中胆固醇明显增加至（5.69±2.2）mmol/L，磷脂减少不明显（0.52±0.168）mmol/L。根据Small三角 ［3］ ，显然已是成石胆汁。
3.2.4 糖尿病加高胆固醇饲养大耳白兔胆囊胆汁成分的特点 总胆汁酸明显低于正常，鹅去氧胆酸明显减少，但胆酸增加不明显。胆囊胆汁中胆固醇明显增加至（5.01±1.35）mmol/L，磷脂增