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【摘要】 目的 研究心脏缺血预适应对心脏缺血/再灌注（I/R）损伤的保护机制。方法 建立在体家兔心脏I/R模型，测定腺苷含量、CK、LDH漏出率及心肌梗死面积，并观察心肌的组织切片和超微结构，用SAS软件包作成组t检验处理，以观察缺血预适应对I/R心肌损伤的保护效应。结果 缺血预适应组心功能恢复明显好于对照组（P<0.01），CK、LDH漏出率及心肌梗死面积均低于对照组（P<0.01），同时伴有心肌组织腺苷含量增高（P<0.01）。结论 缺血预适应对I/R损伤具有保护作用，腺苷可能介导这种保护效应。
关键词 缺血预适应 心肌保护 腺苷
Cardioprotection with ischemic preconditioning mediated by adenosine in rabbits Ding Jiawang，Liu Xianzhe，Yang Jun，et al.
Department of Cardiology，the First Clinical Medical College of Three Gorges University， General Hospital of Yichang，Yichang443003.
【Abstract】 Objective The aim of this study was to determine the role of adenosine in the myocardial protection with ischemic preconditioning（IPC）.Methods Protective effect of ischemic preconditioning on myocardium injured by ischemia/reperfusion（I/R）was observed.Results （1）The recovery of heart function in IPC group was better than that of control group（P<0.01）;（2）LDH and CK leakage in IPC group were lower than that of contorl group（P<0.01）;（3）Infarct size in IPC group was smaller than that in control group（P<0.01）;（4）Myocardium adenosine content in IPC group was higher than that in control group（P<0.01）.Conclusion IPC posseses protective effect on myocardium inˉjured by I/R，in which a
denosine plays a crucial role.
Key words ischemic preconditioning cardioprotection adenosine
1986年Murry等在犬模型上观察到多次短暂缺血可以提高心肌组织对随后持续缺血的耐受性，从而提出了缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）的概念。随后研究发现狗、猪、兔、大鼠和人都可产生缺血预适应，但其具体机制不清楚。目前，提出了几种假说，即腺苷作用，缓激肽、K-ATP通道，α1受体等。Kitakaze等曾在缺血预适应模型中观察到5’-核苷酸酶含量明显高于对照组，由此推断内源性腺苷可能参与了缺血预适应。
本文通过建立在体家兔心脏缺血/再灌注模型，观察了缺血预适应的心肌保护效应，并测定心肌组织腺苷含量，旨在探讨腺苷与缺血预适应心脏保护效应的内在关系。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备 健康雄性家兔36只，体重2.5～3.0kg，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。采用3%戊巴比妥钠（30mg/kg）耳缘静脉推注麻醉，气管切开并插管，6F导管经颈动脉插入左心室并与RM-6280多导生理仪记录和分析系统相连;开胸暴露心脏，在冠脉左室支主干上中1/3处分离、穿线，提起后以套管夹夹闭造成冠脉阻塞。心肌缺血依据心电图ST段抬高，再灌注依据ST段下降1/2确认。
1.2 实验分组 待动物的血压、心率和心电图稳定后，记录有关观测指标作为正常对照值。然后随机将实验动物分为3组，每组12只:（1）对照组（Conˉtrol）即单纯缺血/再灌注（I/R）组:缺血40min，再灌注60min;灌注结束后将其中6只家兔用于确定心肌梗死范围，另外6只用作心肌组织腺苷含量和心肌形态结构分析;（2）缺血预适应组（IPC）:缺血5min，再灌注10min，重复3次;余同第一组;（3）假手术组（Sham），仅作冠脉穿线及插管，不作缺血/再灌注处理，余同第一组。
1.3 观察指标
1.3.1 心功能参数测定 心脏跳动稳定后，通过压力换能器在记录仪上描记左室内压（LVP）曲线及测定左室内压峰值（LVSP），将LVP电信号输入微分器描记左室dp/dt曲线和测量左室内压最大上升速率（+dp/dt max ）。所有图形数据存入RM-6280分析处理系统中进行
处理。
1.3.2 心肌损伤指标 再灌注结束后，通过导管取动物血浆，并使用全自动生化分析仪测定CK和LDH浓度。
1.3.3 腺苷含量的测定 再灌注结束后，取各组左室缺血区心肌组织0.5g置入事先加入3:10.5mol/L HClO 3 预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下制成心肌匀浆，低温离心，取上清液采用高效液相色谱法测定腺苷含量。
1.3.4 心肌梗死范围测定 实验结束后，结扎冠状动脉，左心室注入2～3%Evans蓝2～3ml确定非缺血区（蓝色）与缺血区（无蓝色）。将缺血心肌分离后以滤纸吸干，置于天平上称重。将缺血区心室肌以平行于房室沟的方向切成5～6片，每片厚2～3mm，置入1%氯化三苯基四氯唑（TTC）磷酸缓冲液（pH7.4）中37℃水浴10～15min。缺血危险区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色。将梗死区和非梗死区分离，滤纸吸干后分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。
1.3.5 心肌组织切片 取心尖部心肌梗死周围组织，常规石蜡切片，HE染色，观察心肌细胞的病理变化。
1.3.6 心肌超微结构分析 灌注结束后，从左室心尖部缺血中心边缘区同一部位每组随机取1例取材，切取1mm 3 全层心肌组织数块，放入0.1mol/L的磷酸戊二醛溶液内（pH7.4）固定，按电镜要求经脱水、包埋、超薄切片、染色，用电子透射显微镜观察心肌超微结构并摄片。
1.4 统计学方法 计量资料以均数±标准差表示，用SAS软件包作成组t检验处理，计算P值，并设Ⅰ类错误α=0.01。
2 结果
2.1 心率变化、心功能参数及心肌损伤指标 见表1a、1b。
2.2 心肌腺苷含量 见表2。
2.3 组织切片及电镜观察 假手术组:组织切片观察细胞核形态正常，胞浆染色均匀;电镜发现线粒体 嵴密集，肌丝平行排列，肌节结构清晰完整，细胞内有较多糖原颗粒沉积。对照组:细胞明显肿胀，胞浆染色欠均匀，间质水肿，胞浆空泡样变;镜下见肌浆及线粒体高度水肿，肌管高度扩张，肌原纤维局灶性溶解。缺血预适应组:则表现为心肌细胞稍肿胀，间质轻度水肿;肌浆及线粒体水肿较轻，线粒体嵴排列较整齐，肌管轻度扩张（见图1、图2）。表1a 心率及心功能的变化 （略）注:与对照组比较 ˇ P<0.01
2.4 心肌梗死面积 见表3。如表3所示，预适应组梗死面积明显低于对照组（略）。注:Ar:危险区;Ai:梗死区。与对照组比较 ˇ P<0.01
2.5心肌腺苷含量与梗死面积的关系与对照组相比缺血预适应组心肌腺苷含量升高，同时可见其梗死面积缩小，两者之间呈显著负相关（r=-0.8456，P<0.01）。
3 讨论
1986年Murry等首先提出了缺血预适应（IPC）的概念。随后研究发现动物和人都可产生缺血预适应，但其具体机制不清楚 ［1，2］。心脏反复短暂缺血后，可使心肌在随后持续性缺血中得到保护，其效应包括缩小心肌梗死范围、减少再灌注心律失常和促进心功能恢复。本实验结果提示，家兔心脏经缺血5min，再灌注10min，重复3次后，对随后缺血40min、再灌注60min的缺血/再灌注损伤具有明显的保护作用。预适应组家兔的心肌梗死面积显著缩小，心肌酶漏出减少，心功能恢复良好，心肌形态结构损伤较轻。
缺血预适应概念的提出为缺血心肌的保护及其机理探讨开辟了崭新的领域，但是目前就其作用机制尚不完全清楚。腺苷及其受体在缺血预适应心肌保护中可能扮演重要角色 ［3，4］ 。动物实验发现，腺苷及其受体激动剂可模拟缺血预适应对心脏的保护作用，而这种效应可被腺苷受体拮抗剂阻断。腺苷A 1 受体激动剂R-PIA预适应家兔心脏可限制心肌梗死范围，而A 1 受体拮抗剂DPCPX可消除这种效应。Carr等发现高选择性腺苷受体激动剂CPA和选择性A 3 受体激动剂IB-MECA对人心房肌均可产生缺血预适应同样的效应，从而认为A 3 受体可能也参与缺血预适应 ［5，6］ 。本文结果提示，缺血预适 应组家兔心肌组织腺苷含量明显高于对照组，并且心肌梗死面积缩小的程度与局部腺苷水平呈负相关，这从另一个角度进一步说明腺苷可能介导缺血预适应的保护作用。
腺苷是机体能量代谢的产物，主要来源于ATP降解。心脏短暂缺血后大量ATP降解，局部心肌组织腺苷积聚。有人在动物实验研究中发现，IPC时冠状静脉窦中腺苷的浓度升高。腺苷参与缺血预适应的途径可能包括:（1）抑制白细胞介导的细胞损伤;（2）增加冠脉血流，改善心肌灌注;（3）负性变力、变时和变传导作用。腺苷的这些作用大多通过其A 1 受体与Gi偶联 ［7］ ，激活磷脂酶C产生二酰基甘油并激活蛋白激酶C，使之从细胞质转位到细胞膜，并磷酸化K ATP 使之开放，K + 外流增加，导致动作电位时程和不应期缩短，抑制Ca 2+ 内流，减轻钙超载及减少ATP消耗而发挥保护作用 ［8］ 。（本文图片见封三）
参考文献
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（收稿日期:2004-07-09）
作者单位:1443003湖北宜昌三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院心内科
华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科 （编辑李 木）