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【摘要】 目的 肿瘤坏死因子是一种参与哮喘病发生及进展的细胞因子。研究发现哮喘病人中TNF-308等位基因A的比例较无哮喘病者为高。检测肿瘤坏死因子基因多形性（G-308A）是否存在种族差异以及在华人、马来人和印度人中其与哮喘病的关系。方法 本研究共收集了303例肺科医生诊断的哮喘病人（145例华人，73例马来人和85例印度人）以及355名无偿供血者。TNF-308基因型多形性通过限制性基因片段多形性方法获得（RFLP）。不同种族之间等位基因的比例差异，TNF等位基因-308与哮喘的关系通过卡方检验来分析。哮喘与基因型的关系用多元回归分析，以消除年龄与性别的影响。P值设定在0.05。所有的分析由SPSS11.5软件完成（SPSS Inc，Chicago，USA）。结果 我们未发现哮喘病人和健康人TNF-308基因形差异有显著性（P>0.05）。然而，在健康人群中，华人的等位基因-308A比例显著高于马来人（P<0.01），说明此基因的分布存在种族差异。结论 本实验未能发现亚洲人群中哮喘病与TNF-308基因多形性的关系。大样本单倍体研究有助于进一步阐明两者之间的关系。
关键词 哮喘 哮喘严重度 TNF-308基因多形性
The relation between TNFα-308A and asthma in Asia population Zhang Weidong
The Institute for Respiratory Disease of Guangzhou，Guangdong510120.
【Abstract】 Objective Tumor necrosis factor（TNF-α）is a potent modulator of immune and inflammatory reˉsponses，and has been implicated in asthma.Therefore TNFα-308gene may be a candidate gene in asthma.To define the ethnic differences in the prevalence of TNFαgene olymorphism（G-308A）and its association with asthma in three ethˉnicgroups.Methods 03physician-diagnosed asthmatic subjects（145Chinese，73Malay，and85Indian）and355unselected blooddonors（157Chinese，98Malay，100Indian）were recruited.Genotypes of TNFα-308was determined by PCR and restriction enzyme length polymorphism（RFLP）.Results Allele frequencies of TNFα-308were signifiˉcantly different among Chinese，Malay and Indian in the control population（P=0.003）.However，no significant differˉence was found between asthmatics and controls in these three ethnic groups.Conclusion Current data shows that TNFα-308A may not be a risk factor for asthma among Chinese，Malay and Indian.However，the prevalence of TNFα-308A shows racial specificity among the three ethnic groups.Key words asthma asthma severity TNFα-308
哮喘是一种常见的由遗传及环境因素造成的气道炎症性疾病，多种细胞释放的细胞因子及炎性介质导致其气道炎症，并引发一系列的反应，包括血管通透性增加，粘液渗出增加以及气道平滑肌痉挛、增生。尽管环境因素对哮喘的表达起重要作用，流行病学研究证实基因因素对于哮喘的发病起关键作用。然而，影响哮喘发生及发展的基因尚未知晓，且数量较多。候选基因研究（也称为关联研究）是一种揭开基因与哮喘病关系的一种重要方法。
肿瘤坏死因子是一种参与哮喘病发生及进展的 细胞因子，它由壁细胞，气道、组织的巨噬细胞，支气管上皮细胞所分泌。TNF能增加气道的高反应性，诱发气道炎症。研究表明哮喘患者气道内TNF的水平较正常人升高。体外实验证实TNF基因多形性-308等位基因A能增加巨噬细胞分泌TNF的总量。研究发现哮喘病人中TNF-308等位基因A的比例较无哮喘病者为高。故一些研究认为TNF基因多形性-308（G变异为A）与哮喘的发病有关。然而，部分研究却没有发现上述关系。另外，亚洲人群中这方面的数据虽有所描述但仍嫌不足。本研究的目的在于通过比较亚洲人群中TNF-308在哮喘病人和健康人的差异，调查两者之间有无关系。
1 资料与方法
1.1 研究人群 本研究共收集了肺科医生诊断的303例哮喘病人（145例华人，73例马来人和85例印度人）以及355名无偿供血者、健康志愿者。上述人群均来自新加坡国立大学医院。哮喘病人表现为经吸入400μgβ 2 受体激动剂或经2周每天20mg强的松治疗后FEV 1 提高大于预计值的15%。
1.2 哮喘患者分为两类 （1）致命样哮喘:患者（哮喘患者）在入组前6个月内有过哮喘发作而行气管插管、机械通气的经历。（2）非致命样哮喘患者:哮喘患者在入组前6个月内无上述经历者。对照人群为未经选择的无偿供血者、健康志愿者。哮喘患者的基本资料及临床数据通过面试回答的问卷以及病历而获得。对照组人群只提供年龄，性别，种族的基本数据。本研究已由新加坡国立大学伦理委员会批准。表1为研究人群中哮喘病人与健康人的一般情况。病人组年龄比健康人大，两组的性别比例亦存在差距，故在下面的回归分析中我们将校正两者的不同。 表1 研究人群的一般情况研究人群 哮喘病人（略）
1.3 皮肤划痕实验 病人签署书面知情同意书后，研究人员为病人作19种抗原的皮肤划痕实验，以测试患者是否为特异质，即皮肤划痕实验阳性。皮肤划痕实验阳性定义为皮丘直径大于生理盐水阴性对照2mm，所用抗原为:螨虫、尘土、羽毛、猫皮、狗毛、棉絮、草孢子、霉菌、发酵菌、牛奶、小麦、鸡蛋、桔子、 苹果、香蕉、蟹、虾、龙虾和蟑螂（Greer laboratories NC，USA）。
1.4 基因型表达 研究人员从哮喘患者及对照组人群采集10ml外周静脉血。DNA通过盐析法获得。基因型通过限制性基因片段多形性方法获得（RFLP）。首先，包含TNF-308的基因片段被扩增。然后，扩增的产物由限制性内切酶切割，并由2.5%的溴化乙啡啶着色的凝胶分离。
1.5 统计学方法 不同种族之间的等位基因的比例差异，TNF等位基因-308与哮喘的关系通过卡方检验来分析。哮喘与基因型的关系用多元回归分析，以消除年龄与性别的影响。P值设定在0.05。所有的分析由SPSS11.5软件完成（SPSS Inc，Chicaˉgo，USA）。Hardy-Weinsberg Disequilibrium通过Arˉlequin软件计算。
2 结果
哮喘病人和健康人TNF-308基因多形性见表2。所有健康人群中的基因型都符合Hardy-Weinsˉberg Disequilibrium方程，进一步证实了我们实验结果的可靠性（P<0.05）。我们分别比较了三个种族中TNF-308在哮喘病人和健康人的不同。我们未发现哮喘病人和健康人TNF-308基因形差异有显著性（P>0.05）。然而，在健康人群中，华人的等位基因-308A比例显著高于马来人（P<0.01），说明此基因的分布存在种族差异。
我们将哮喘患者据病情分为致死样哮喘，非致死样哮喘，并首次在亚洲人群中进一步分析了其与TNF-308基因多形性的关系。然而，我们未发现TNF-308基因多形性与上述分型的联系（表3）。
3 讨论
3.1 TNF-308基因多形性与哮喘病的关系 本研究未能发现亚洲人群中TNF-308基因多形性与哮喘病的关系。本实验的结论与既往的一项小规模的研究是一致的（Tan E C，1999）。在上述研究中，该作者只调查了华人及马来人，其对照组中TNF-308A的比例为华人（23.8%），马来人（3%），与本实验中华人（21.7%），马来人（8%）差异无显著性。 到目前为止，不仅不同种族之间的研究结果缺乏一致性，而且即使在同一种族中，TNF-308基因多形性与哮喘病关系的结论也不一致。MOFFAT曾报导白种人哮喘患者中TNF-308A比例高，而ALˉBUQUERQUE则在所研究的白种人中得出结论，认为TNF-308G可能与哮喘有关。表2 亚洲人群中哮喘病人和健康人肿瘤坏死因子-308基因型与等位基因的分布 例（%）种族 研究群体 人数 基因型（略） 注:P 1 :致死样哮喘vs对照组;P 2 :非致死样哮喘vs对照组 本研究未能发现亚洲人群中TNF-308基因多形性与哮喘病的关系有下列几种可能性。首先，体外实验中TNF-308基因多形性的功能有待于进一步明确。一些体外实验证明TNF-308等位基因A能增加TNF的产量，另外一些研究则未发现上述现象。故有人推测TNF-308基因与TNF的产生与该基因的精细结构和所用的细胞种类有关。因此，在缺乏确切的生物学证据情况下，一些阳性的结果可能为偶然性发现或者为其它相关基因所致。其次，种族之间的差异亦可能导致某些种族结果阳性，一 些种族阴性。另外，哮喘病有许多亚型，如特异质性 哮喘，非特异质性哮喘，运动性哮喘，职业性哮喘等。每一亚型可能由不同的基因所决定。而本研究的哮喘未再分类，故可能较难发现该基因与哮喘病的关系。最后，哮喘是一种多基因及环境因素所决定的疾病，因而，不同研究者的研究对象可能存在多种遗传及环境方面的差异，其研究结果亦难保持一致。
3.2 TNF-308基因多形性与致死样哮喘 本实验虽然进行了一个新的尝试，但未能发现TNF-308基因多形性与致死样哮喘的关系。这可能与下列因素有关。首先，在哮喘的基因研究中，致死样哮喘可能不是一个很好的指标。致死样哮喘的诊断与医生，病人和环境有关。医生方面的因素包括诊断是否及时、准确，对病情评价是否客观;患者方面的因素包括是否对自己的病情有充分的认识，对治疗的依从性及自身的经济情况等等。环境因素包括患者接触过敏原的频率及强度的差异等等。总之，致死样哮喘可能是一个有用的临床诊断，但它并不能代表一个统一的表现型，故其在基因研究中有一定的局限性。
4 结论
本实验证实TNF-308基因多形性可能存在种族差异，却未能发现哮喘病与TNF-308基因多形性 的关系。大样本，单倍体研究有助于进一步阐明两 者之间的关系。
参考文献
1 Tan EC，Lee BW，Tay AWN，et al.Asthma and TNF variants in Chinese and Malays.Allergy，1999，54:401-408.
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4 Changani T，Pare PD，Zhu S，et al.Prevalence of tumor necrosis factor alˉpha and angiotensin converting enzyme polymorphisms in mild/moderate and fatal/near fatal asthma.Am.J.Respir.Crit.Care Med，1999，160:278-282.
（收稿日期:2004-07-16）
作者单位:510120广东省广州呼吸病研究所 （编辑海 涛）