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【摘要】 目的 研究甲巯咪唑（MMI）对体外培养人的甲状腺细胞增殖的影响，以探讨MMI的药理作用，为指导临床用药提供一个理论依据。方法 甲状腺细胞培养2天，之后分别培养在5H和6H液中，不同浓度MMI（1、10、100μmol/L）状态下孵育2天。以竞争性蛋白结合法测定cAMP。采用四氮唑蓝比色法测定甲状腺细胞增殖。结果 MMI在较大范围（1～100μmol/L）内不影响细胞内的第二信使cAMP的含量。在细胞增殖实验中，小剂量MMI（1～10μmol/L）对甲状腺细胞增殖无明显影响，大剂量MMI（100μmol/L）抑制甲状腺细胞增殖。结论 MMI对体外培养人的甲状腺细胞的生长有影响。
关键词 甲巯咪唑 环磷酸腺苷 甲状腺 细胞培养
Effects of MMI on human thyroid cells growth in culturing human thyroid follicles
Yang Qingshan，Liu Yuanyuan，Liu Yongzhang，et al.
Jinzhou Medical College，Liaoning121001
【Abstract】 Objective To explore MMI pharmacology action，and the effects of MMI on human thyroid cells growth was in culturing human thyroid follicles.These help clinical therapy and provide a theory foundation.Methods Thyroid follicles were cultured for2days.Then，the follicles were exposed to MMI（1、10、100μmol/L）in5H or6H for2days.Radio-immunoassay was used to detect cAMP productions in cultured system.Effects of MMI on thyroid cells proliferation were examined by MTT colorimetry.Results MMI failed to affect cellular cAMP generation over a broad range of concentrations（1～100μmol/L）in cultured cells.In thyroid cell proliferation experiments，1～10μmol/LMMI had no effect on cells proliferation，100μmol/L MMI inhibited thyroid cells proliferation.Conclusion MMI plays an important role in affecting thyroid cells growth in cultured human thyroid follicles.
Key words MMI cAMP thyroid cell culture
甲巯咪唑（MMI）又称他巴唑，为硫脲类抗甲状腺药。早在1949年，MMI被首次应用作为治疗甲亢的抗甲状腺药，直至现在临床上仍一直用这种药作为甲亢治疗的首选药。目前，关于在体外培养甲状腺细胞的实验中MMI对甲状腺细胞生长的直接影响报道尚少。我们采用四氮唑蓝（MTT）比色法研究MMI对体外培养的人甲状腺细胞生长的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 由锦州医学院附属第一医院提供甲状腺腺瘤旁正常组织。试剂及药品:MMI，MTT，牛TSH，Ⅳ型胶原酶（美国Sigma产品），1640培养基（美国Gibco产品），胎牛血清（天津生物制剂厂），胰蛋白酶（Serve公司产品）， 125 I—cAMP试剂盒（中国原子能科学研究院）
1.2 甲状腺细胞的分离培养 细胞培养液配成两种6H液和5H液。6H液为1640培养液且含5%胎牛血清、胰岛素10mg/L、谷氨酰胺300mg/L、丙酮酸钠110mg/L、bTSH1mU/ml;5H液除不含bTSH外，余成分同6H液。手术取甲状腺腺瘤患者瘤旁正常甲状腺组织，经预热（37℃）的0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅳ型胶原酶消化60～90min，用不锈钢纱网（200目）过滤，离心沉淀悬于6H液中，细胞计数，于24孔培养板加入细胞悬液1ml/孔（含细胞数8×10 5 /孔），置37℃、5%CO 2 孵箱培养，每24h换液1次，孵育2天。
1.3 实验分组 实验当天换液后各加入1ml以下几组试验液:（1）5H对照（2）5H+1μmol/L MMI（3）5H+10μmol/L MMI（4）5H+100μmol/L MMI（5）6H对照（6）6H+1μmol/L MMI（7）6H+10μmol/L MMI（8）6H+100μmol/L MMI。每组六孔重复试验，继续培养2天。放射免疫法测定每孔cAMP含量和MTT法测定每孔吸光度值。
1.4 放射免疫法测定cAMP含量 上清液吸出后，用胰酶消化细胞，吸除消化液后，用冰冷的0.24mol/L高氯酸吹打细胞，收集细胞，细胞计数，置于青霉素小瓶内。利用 125 I—cAMP试剂盒蛋白竞争法测定cAMP含量。
1.5 甲状腺细胞增殖的测定 实验当日，每孔加入MTT液（5mg/mL）20μl，37℃继续孵育4h，终止培养。以1500r/min离心10min，小心吸弃上清液，用无水乙醇150μl溶解，充分振荡10min，以波长为490nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。
1.6 统计学方法 所有数据均以ˉx±s表示两组间计量资料比较用t检验。
2 结果
2.1 MMI对cAMP的影响 MMI在较大范围内（1～100μmol/L）对cAMP含量无明显影响，6H各浓度组比5H各浓度组cAMP的含量高（P<0.01）见表1。
表1 不同浓度MMI对培养人的甲状腺细胞cAMP含量的影响 （略）
注:实验组与对照组比较t检验，与对照组比较，差异无显著性
2.2 MMI对甲状腺细胞增殖的影响 MMI浓度在1～10μmol/L时，对细胞增殖无明显影响;MMI浓度在100μmol/L时，抑制细胞增殖，6H各浓度组比5H各浓度组明显促进细胞增殖（P<0.01），见表2。
表2 不同浓度MMI对培养人的甲状腺细胞增殖的影响 （略）
注:实验组与对照组比较t检验，与对照组比较， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01
3 讨论
MTT能被活细胞摄取，并经完好的线粒体裂解为有色产物-formazan，其含量可用分光光度计测定，故MTT可特异性地检测细胞的存活和增殖，并 显示其活性 ［1］ 。本文采用MTT法检测MMI对人甲状腺细胞增殖的影响。
目前，各种研究表明促进甲状腺细胞增殖至少存在两种通路 ［2］ :第一条通路是由TSH介导依赖于cAMP信号转导系统;第二条通路是由胰岛素样因子-1（IGF-1）介导非依赖于cAMP信号转导系统。从表1、表2首先观察到6H液可明显促进甲状腺细胞增殖，同时也观察到6H液可明显增加甲状腺细胞内cAMP的含量，表明了TSH可以通过cAMP信号转导系统促进细胞增殖。
从表2可见小剂量的MMI（1～10μmol/L）对甲状腺细胞增殖无明显影响，而大剂量的MMI（100μmol/L）可抑制甲状腺细胞增殖。由表1可见MMI在较大范围内（1～100μmol/L）对细胞内cAMP的含量无明显影响，表明了MMI对甲状腺细胞增殖的影响可能不是依赖于cAMP信号转导系统。大剂量的MMI可能是通过抑制通路二（即胰岛素样因子-1信号转导系统）来抑制甲状腺细胞增殖 ［3］ 。此外，大剂量的MMI还可能通过抑制细胞周期的S期来抑制甲状腺细胞的增殖 ［4］ 。也有研究表明 ［5］ :硫脲类药物（如MMI）可通过降低细胞内ATP的含量及直接抑制线粒体内细胞色素C氧化酶活性而具有破坏细胞生长及抗细胞增殖的特性。
Taniguchi ［3］ 等人用 3 H胸腺嘧啶掺入法得到了大剂量MMI在无TSH时抑制甲状腺细胞增殖，这与本实验结果相同，但该文献在有TSH时促进甲状腺细胞增殖的结果，这与本实验结果略有不同，其结果的差异可能是由于实验条件、选用方法不同所致。有待进一步研究探讨。
参考文献
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（收稿日期:2004-09-09）
作者单位:121001辽宁省锦州医学院
（编辑名 兰）