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【摘要】 目的 研究大黄素和黄芪多糖联合给药抑制大鼠肝癌发生、发展的作用。方法 采用二乙基亚硝胺（diethylniˉtrosamine，DEN）诱发的大鼠肝癌模型，SD大鼠60只随机分为5组，诱癌同时给予大黄素和黄芪多糖干预治疗。从实验第8周开始每周处死部分大鼠，化验血清肝功指标ALT、γ-GT和α-岩藻糖苷酶（α-L-fucoxidase，AFU），并行病理检查，实验第18周处死所有大鼠。结果 大黄素和黄芪多糖联合给药组的体重、各项肝功指标、肝癌发生的时间和病理分级均较模型组有明显改善。结论 联合给予大黄素和黄芪多糖对大鼠肝癌的发生、发展有一定的抑制作用。
关键词 黄芪多糖 大黄素 肝癌 中药
Inhibitory effect of emodin and astragalus polysaccharides on hepatocarcinoma in rats
Yuan Lichao，Cheng Yan’an，Dang Shuangsuo，et al.
Department of Infectious Diseases，The Second Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an710004
【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect of emodin and astragalus polysaccharides on hepatocarcinoˉma in rats.Methods We used rat hepatocarcinogenesis model induced by diethylnitrosamine（DEN）.Rats were adminˉistered with emodin and astragalus polysaccharides when they were induced by DEN.To be tested serum indexes ALT，γ-GT，α-L-fucoxidase（AFU），and examined by pathology.Part of rats were executed every week from the eighth week.All spare rats were executed at the eighteenth week.Results The group administered with emodin and astragalus polysaccharides was improved better than any other group in rat’s weight，all kinds of serum indexes，time of hepatocarˉcinogenesis，and pathology classification.Conclusion Emodin and astragalus polysaccharides have partial inhibitory efˉfect on hepatocarcinoma in rats.
Key words astragalus polysaccharides emodin hepatocellular carcinoma herb
大黄素是从中药大黄中提取的有效单体，是多种中药的有效成分之一，既往研究证明大黄素对乳腺癌细胞、肺癌细胞的生长有一定抑制作用。黄芪多糖是从中药黄芪中提取的有效单体，能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，提高巨噬细胞吞噬功能，增强NK细胞活力，通过增强宿主免疫反应发挥抗肿瘤作用。我们通过DEN诱导的肝癌模型，研究大黄素和黄芪多糖联合给药对肝癌的预防作用。
1 材料与方法
1.1 药品与仪器 DEN，>0.99g/ml，Sigma公司产品，临用前配成0.2%DEN溶液;大黄素，>95%，购自西安崇信天然添加剂有限公司，临用前配成0.8% 大黄素混悬液;黄芪多糖，>65%，购自西安鸿生生物技术有限公司，临用前配成8%黄芪多糖溶液。日立7170型全自动生化分析仪。
1.2 实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠60只，3～4月龄，体重（350.2±20.3）g，购自西安交通大学实验动物中心，所有动物分笼饲养于我校实验动物房，适应环境7天。全部大鼠随机分为5组:正常对照组（A组）、模型组（B组）、大黄素组（C组）、黄芪多糖组（D组）、大黄素和黄芪多糖联合给药组（E组），B组有20只老鼠，其余各组均为10只老鼠。
1.3 给药方法 除A组外，其余各组均给予0.2%DEN灌胃，按10mg/kg体重给药，每周5次，至14周停药。同时C组给予大黄素混悬液灌胃，按40mg/kg 体重给药;D组给予黄芪多糖液灌胃，按200mg/kg体重给药;E组给予大黄素和黄芪多糖联合给药，剂量同C组和D组。A组给予等量生理盐水灌胃，至14周停药。
1.4 观察与处死 每周称一次体重。从实验第8周以后每周各组均处死1只大鼠，麻醉后断尾采血，收集血清，用自动生化分析仪检测各项肝功指标，实验第18周处死所有大鼠。
1.5 取材及固定 动物处死后均剖开腹腔，剪取整个肝脏，记录一般情况及表面癌结节数，称肝重，统一取结节处、结节周围及远离结节处共三块标本，均为1cm×1cm×1cm大小，较好的标本照相留存，并全部在10%甲醛溶液中固定，再用该液浸泡固定24h。固定后送至病理科制备成5μm厚的切片，HE染色，常规组织学检查。
1.6 统计学方法 计量资料用均数±标准差（ˉx±s）表示，两组间均数比较采用t检验，结果用统计软件SPSS11.0进行处理。
2 结果
2.1 体重 实验第1周时，B、D、E组大鼠体重和A组差异均无显著性。实验第18周除E组大鼠外，其余各组大鼠体重均明显低于A组，经统计学分析差异有显著性。实验前后E组大鼠体重和A组差异均无显著性。见表1。
表1 各组大鼠体重结果比较 （略）
注: ˇ 表示各组均和A组比较所得P值。P 1 为第1周体重比较所得结果，P 18 为第18周体重比较所得结果
2.2 肝功 与A组比较，其余各组大鼠的ALT、γ-GT、AFU均明显升高，经统计学分析差异有显著性（P<0.05）。B组各项指标升高最明显，经统计学分析与E组比较差异有显著性（P<0.05），但和C组、D组比较差异无显著性（P>0.05）。见表2。
表2 各组大鼠肝功结果比较 （略）
注: ˇ 表示各组和A组比较，P<0.05。 Δ 表示各组和B组比较
2.3 病理 巨检发现:A组大鼠肝脏表面光滑，色淡红，边缘锐利，质地中等。其余各组大鼠肝脏表面均散在大小不等的白色结节，质地较硬。其中E组大鼠自实验第14周肝脏表面开始出现白色结节，结节数较其余各组明显减少，且结节直径较小。B、C和D组大鼠自实验第11周肝脏表面开始出现白色 结节，结节大小差异无显著性，部分肝脏表面有单个较大的结节出现。
HE染色:镜下见A组大鼠无一例出现自发性肝癌，肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，细胞核清晰。其余各组大鼠均诱发出肝癌，正常肝小叶结构被破坏，白色结节为肝细胞癌。B组肝癌分级多为Ⅲ级，C和D组多为Ⅱ～Ⅲ级，E组多为Ⅰ～Ⅱ级，癌细胞分化程度较高。
3 讨论
本研究给予大鼠DEN灌胃共14周，最后经病理证实全部诱发出肝癌。Qian等 ［1］ 报道病理过程大致分为3个阶段:在诱癌的第1～8周为肝硬变前期，表现为中毒性肝炎;第8～12周为肝硬变期;第12～18周为癌变期。很好的模拟了人肝癌的发生、发展过程。所以，我们采用DEN诱发的大鼠肝癌模型，观察大黄素和黄芪多糖对肝癌发生、发展的抑制作用，探讨大黄素和黄芪多糖抑制肝癌形成的机理，进而为防治肝癌寻找新的有效药物。
从各组大鼠体重比较结果可以看出，只有E组大鼠的体重在诱癌后与正常对照组比较无明显下降。由于DEN对大鼠的毒性作用，B、C、D组诱癌后体重与正常对照组比较均有不同程度的下降。在实验过程中，E组大鼠的进食量从第10周以后才开始下降，较B、C、D组晚，所以大黄素和黄芪多糖联合给药，可以减轻DEN的毒性作用，改善大鼠一般情况。肝细胞癌患者血清中AFU的活性明显高于继发性肝癌和肝硬化，在AFP阴性肝癌和小肝癌患者血清中AFU阳性率分别为76.1%和70.8% ［2］ 。本实验观察到所有诱癌组大鼠血清AFU水平均明显高于正常对照组，说明AFU是很好的肝癌标志物，给予大黄素和黄芪多糖干预的E组明显低于B组水平，但是C组和D组与B组比较差异无显著性。贺学强 ［3］ 等的研究表明:大黄素可以抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖，且其抑制作用明显强于5-FU。黄芪多糖对肝癌细胞HepG2有抑制作用。但是大黄素和黄芪多糖对大鼠肝癌的作用报道较少。本实验研究结果表明:大黄素和黄芪多糖联合给药组的体重、各项肝功指标、肝癌发生的时间和病理分级均较模型组有明显改善，提示联合给予大黄素和黄芪多糖可以改善肝功，延缓肝癌发生，对大鼠实验性肝癌发生、发展有一定的抑制作用。但是模型组和各给药组均全部诱发出肝癌，各给药组均未完全阻断肝癌的发生，大黄素组和黄芪多糖组在肝癌发生时间和病理分级上与模型组差异无显著性，原因可能是观察样本量不够 ［4］ ，另外还有待于寻找更为敏感的肝癌标志物。大黄素和黄芪多糖抑制肝癌发生的机制还有待于进一步研究。
参考文献
1 Qian Y，Ling CQ.Preventive effect of Ganfujian granule on experimental hepatocarcinoma in rats.World J Gastroenterol，2004，10（5）:755-757.
2 Wang JJ，Cao EH.Rapid kinetic rate assay of the serum alpha-l-fuˉcosidase in patients with hepatocellular carcinoma by using a novel subˉstrate.Clin Chim Acta，2004，347（1-2）:103-109.
3 贺学强，严祥.大黄素对肝癌细胞SMMC-7721抑制作用及P53、C-myc蛋白的表达.中华实用中西医杂志，2003，3（9）:1297-1298.
4 党双锁.医学常用实验技术精编.西安:世界图书出版社，2004，270.
（收稿日期:2004-09-23）
作者单位:710004陕西西安西安交通大学第二医院感染科
（编辑莉 莉）