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【摘要】 目的 应用对红细胞补体受体1分子（CR 1 ）容量检测的实验方法，研究其对淋巴瘤的临床价值。 方法 戊二醛固定红细胞，每份样本将3×10 9 的红细胞定量“液相包被”于V型板中，依次加入抗红细胞CR 1 单抗碱性磷酸酶标记的第二抗体及可溶性底物显色，移显色液于比色孔，405nm比色，计算其吸光度A值。 结果 正常健康人红细胞CR 1 分子数明显高于淋巴瘤患者（P<0.01）。 结论 红细胞CR 1 量表达及其变化与淋巴瘤的发生发展及转归有明显的相关性。故对该疾病的诊断及疗效的评价有重要的临床价值。
关键词 红细胞 补体受体 淋巴瘤
Clinical significance of quantitative expression of complement receptor type1on erythrocytes in patients with lymphoma
Yan Jiayun，Li Junjun，Yu Hairen，et al.
The First Hospital Affiliated to Nanhua University，Hengyang421001.
【Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of quantitative expression of complement recep-tor type1on erythrocytes（ECR 1 ）in patients with lymphoma.Methods In each sample glutaraldehyde-fixed red blood cells（RBC）of3×10 9 were analyzed in V well microtiter plates.The second antibody of antialkaline phos-phatase and the soluble substrate were added following3washes in S/BSA.The supernatant was transferred to a clean U microtiter plate to faclitate in a plate reader at405nm and compute the absorbance（A）.Results The quantitative expression on ECR 1 in patients with lymphoma was significantly lower than that of healthy individuals（P<0.01）.Conclusion Quantitative expression of ECR 1 might play an important role in the pathogenesis，and it is significantly correlative with the development of lymphoma.Quantitative expression of ECR 1 might have clinical significance in di-agnosing and evaluating prognosis in patients with lymphoma.
Key words erythrocyte complement receptor lymphoma
补体结合抗原抗体复合物（IC），使抗原抗体复合物保持在可溶性状态，从而使其与转运系统结合参与免疫反应，而红细胞主要担负血管中与补体结合IC的清除。从20世纪50年代以来国内外学者对红细胞上的CR 1 分子及红细胞免疫黏附作用进行研究，1993年Jones使用ELISA技术测定完整红细胞上CR 1 数量，笔者在此基础上使用了细胞酶免疫分析法测定完整红细胞上的CR 1 分子，从而使该检测方法应用于淋巴瘤辅助诊断、指导治疗以及对病情预后判断，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 血液标本 EDTA抗凝血1ml在采集后4h检测。对照组标本取自健康体检人群58例;淋巴瘤43例（其中非霍奇金淋巴瘤15例，霍奇金病28例），均系住院确诊病例，符合血液学淋巴瘤的诊断标准。
1.2 Buffer液 常规使用的PBS（等张pH=7.2的磷酸盐缓冲液）;其它缓冲液有S/BSA∶0.15mol/L生理盐水+2g小牛血清+1g/L叠氮钠，PBS/BSA∶含有20g/L BSA+1g/L叠氮钠的PBS分别装于25ml的容器中，保存于4℃冰箱中。1.3 红细胞制备 EDTA抗凝血用PBS洗涤4次，每次去除缓冲液及上清液，清除血液中的淋巴细胞及血小板，取0.1ml红细胞置于干净试管中，加入0.9ml S/BSA和0.1ml用PBS配制的戊二醛，充分混匀，置于室温30min，再将红细胞用S/BSA洗涤1次，用PBS配成2%的浓度分装1ml，保存于-70℃中。
1.4 免疫试剂 鼠抗人CR 1 单抗（IgG1，E11克隆），鼠抗人CD2单抗（无关单抗），碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG。
1.5 底物 即用即配。
1.6 测定方法 将红细胞悬液于常温下溶解并于使用前充分混匀。（1）将V型滴定板每孔加入20μl2%的红细胞悬液，每孔用160μl S/BSA将红细胞洗涤1次，V型板经水平离心1800r/min，离心3min，弃上清液保留红细胞;（2）在每孔中加入10μl的一抗（鼠抗人CR 1 单抗，CD2单抗，用PBS/BSA稀释），阴性对照组用绵羊红细胞（无CR 1 分子）进行测定，微量滴定板在37℃放置孵育50min，然后用S/BSA洗涤3次;（3）每孔加10μl酶标记的羊抗鼠IgG二抗37℃孵育50min，然后用S/BSA洗涤3次;（4）将20μl的S/BSA及40μl的底物加入每孔37℃放置90min，每隔15～20min轻轻振动，以保证红细胞最大限度与底物接触;（5）最后于每孔加入60μl的PBS离心，吸取上清液100μl移入另一干净空白U型比色板，在405nm读取其A值。
1.7 统计学方法 所有实验数据均经方差分析，发现差异有显著性的实验组（P<0.05）后，再于组内做t检验，对比组内各数据间差异的显著性。P<0.05差异有显著性;P<0.01差异有非常显著性。
2 结果
2.1 正常人红细胞CR 1 分子分布特点及与淋巴瘤患者的红细胞CR 1 分子表达的差异 测定58例健康成年人和43例淋巴瘤患者的红细胞CR 1 分子浓度及表达，差异有非常显著性（P<0.01），并根据红细胞CR 1 分子表达的程度测 得A值，发现二者具有明显的差异（A值>1.00为高表达;A值0.50～1.00为中表达;A值<0.50为低表达）。淋巴瘤患者则呈显著的低表达，霍奇金病（HD）与非霍奇金淋巴瘤（NHL）无明显差异。见表1。
表1 正常人群与淋巴瘤CR 1 分子的分布 例（略）注: * 高表达，A值>1.00; ** 中表达，A值为0.50～1.00; *** 低表达，A值<0.50
2.2 淋巴瘤患者CR 1 分子的动态测定及意义 淋巴瘤患者红细胞CR 1 分子表达随病情的改变而变化，疾病处于治疗前期，患者红细胞分子CR 1 表达明显下降，当疾病确诊后予以正规放疗或化疗，此时红细胞CR 1 分子表达仍下降，当疾病缓解后进入巩固治疗阶段，红细胞CR 1 分子表达则明显回升。图1所示，A为治疗前期测定的A值，B为治疗中测定的A值，C为缓解期测定的A值，D为巩固治疗期测定的A值。
图1 淋巴瘤患者不同时期CR 1 分子的动态表达
2.3 不同时期淋巴瘤患者在红细胞分子CR 1 表达的变化 在43例淋巴瘤患者中，其中Ⅰ期8例，Ⅱ期19例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例。通过对红细胞CR 1 分子含量的测定结果显示其红细胞CR 1 分子表达均明显减低，尤其是Ⅲ期与Ⅳ期患者在CR 1 分子表达则显著低下，其A值分别降低至0.2与0.15。
3 讨论
文献报道红细胞免疫黏附功能对循环内免疫复合物具有强大的辅助清除作用。CR 1 是红细胞免疫功能的重要物质，CR 1 分子还具有促进T、B细胞活化的功能 ［1，2］ 。红细胞中广泛存在CR 1 分子，在数量上虽然仅相当于白细胞膜上CR 1 分子的1%～2%，但为成簇分布，且单位容积血液内红细胞数大于白细胞3个数量级。其与循环免疫复合物、抗原物质及其它机体细胞接触机会是白细胞的500～1000倍 ［3，4］ 。故CR 1 总数的95%以上存在于红细胞，这也是红细胞免疫功能的重要所在，而人体清除与血液中抗体形成的循环免疫复合物（CIC）主要靠红细胞完成，红细胞能吸附抗原抗体形成的复合物和旁路激活黏附补体的抗原使之清 除。此外，CR 1 分子还有促进T、B细胞活化的功能 ［1，2，4，5］ 。由于红细胞CR 1 分子量的多少反映了红细胞免疫黏附和免疫清除力的高低，如CR 1 容量减低，则循环中免疫复合物含量增高 ［3，4］ 。如何提高淋巴瘤血清内红细胞CR 1 分子含量，增强红细胞的免疫吸附功能对疾病的发展与预后至关重要。因此，红细胞膜上CR 1 分子数量的表达状况对机体正常免疫功能维持及临床病理变化具有重要意义。从58例正常人与43例淋巴瘤患者血清中红细胞CR 1 分子容量检测结果分析，正常人红细胞CR 1 分子的表达平均值明显增高，其高表达为74.1%（A值>1.0）;与淋巴瘤患者红细胞CR 1 分子的表达平均值相比差异有非常显著性（P<0.01），且大部分病例A值<0.5，低表达高于70%，小部分为中表达，无一例高表达，尤以NHL更显著（见表1）。并且CR 1 分子的数量表达与疾病的不同时期呈显著的相关性。当确诊后，红细胞CR 1 分子表达明显下降，处于正规放疗及化疗期，红细胞CR 1 分子表达无明显变化;当疾病缓解后并进入巩固阶段红细胞CR 1 分子表达则明显回升，但仍低于正常人群。结合43例临床病例分析，不同时期的淋巴瘤患者红细胞CR 1 分子表达不同，病情愈趋晚期其CR 1 分子表达低下愈显著。由于红细胞清除免疫复合物功能障碍，以及使肿瘤细胞被吞噬作用的减弱，导致了循环中免疫复合物的增高，宿主抗肿瘤的免疫能力进一步破坏，从而使肿瘤逃避免疫攻击得以生长和扩散 ［3～5］ 。因此对淋巴瘤患者进行红细胞CR 1 分子浓度测定在临床上具有重要的应用价值。红细胞CR 1 分子浓度测定方法灵敏度高，有较好的临床应用价值，对于肿瘤患者尤其是淋巴瘤患者及其他自身免疫性疾病患者均可发现CR 1 分子量的明显改变，是临床对该类疾病的诊断与疗效判断又一重要的参考指标。但红细胞的免疫功能与机体其它免疫的关系，如何调控红细胞的免疫功能从而防止或减轻淋巴瘤患者的病理改变，延缓肿瘤的发展尚有待进一步探讨。
参考文献
1 Freysdotir J，Sigfusson A.A flow cytonetric for measuring complement receptor1（CR1 ）and the complement fragments C3d and C4d on erythro-cytes.J Immund Methods，1991，142:45-51.
2 Jones DRE.Detection of red cell sensitiation by antibody and comple-ment:current practice and further porspective.Comp Haematol Int，1993，3:201-207.
3 Jones DRE，Thompson S，Amirdhetty S，et al.An enzyme-linked im-munosobent assay for complement regulatory proteins and membrane-bound immunoblobulins on intact red blood cells.J Immunol Methods，1994，177:235-242.
4 王海滨.红细胞CR1 分子的定量测定及其临床意义.中华微生物学和免疫学杂志，2000，20（4）:381-384.
5 杨远高.红细胞免疫功能与肿瘤转移.中国肿瘤临床，2003，30（1）:68-69.
（编辑晓 华）
作者单位:421001湖南衡阳南华大学第一附属医院