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【摘要】 白血病是造血系统常见的恶性肿瘤，由白血病细胞产生的多药耐药是导致化疗失败的主要原因。ABC转运蛋白超家族的许多成员过度表达是诱导产生白血病多药耐药的重要机制，本文仅就中西药物逆转白血病多药耐药机制与ABC转运蛋白超家族关系进行综述。
关键词 中西药物逆转 白血病 多药耐药 ABC转运蛋白家族
多药耐药（multidrug resistance，MDR）指肿瘤细胞不仅对单一化疗药物出现耐药，而且对化学结构和作用机制不同的药物产生交叉耐药性。化疗杀灭那些敏感的肿瘤细胞后，留下高比例的耐药细胞，导致以后的化疗失败。即使抗肿瘤新药如Mylotarg以及STI-571等仍存在耐药现象，提示临床多药耐药及其逆转仍是肿瘤治疗中不可回避的问题，ABC转运蛋白超家族（ATP-binding cassette transporter superfamily）与白血病多药耐药密切相关。近年来的中西药物逆转白血病多药耐药引人关注，且具有毒性小和不良反应少的优点。
1 ABC转运蛋白超家族与白血病多药耐药
ABC转运蛋白超家族是一组跨膜蛋白，目前已知有49个成员，并且还在继续发现新成员。超家族又分为8个亚家族（ABCA-ABCG，ANSA arsenite and antimonite transporter），按结构可分为全转运子（full transporter）和半转运子（half transporter）。全转运子含有2个ATP结合位点和2个疏水性结构区，半转运子含有1个ATP结合位点和1个疏水性结构区 ［1，2］ 。该家族转运许多结构不同的药物穿过细胞膜，在跨膜区组成通道，底物由通道穿过细胞膜，2个ATP连接区位于细胞浆内面，水解ATP完成底物转运。该家族参与肿瘤多药耐药的主要成员为ABCB、ABCC、ABCG等亚家族。在ABCB亚家族中研究最深入的ABCB1，又名P糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）。由位于人7q21.1的多药耐药基因mdr1（multidrug resistance1）所编码，分子量为170kD。P-gp由1280个氨基酸组成，是一种广谱的多药外排泵，它有2个同源结构，每部分含1个ATP结合位点和1个疏水性结构区，结构区内含6个疏水跨膜结构。自从1976年Juliano发现P-gp后，已证实P-gp高表达为MDR的主要机制，P-gp可以通过它的疏水位点与疏水性抗肿瘤药物结合，通过ATP水解供能，逆浓度梯度将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药。P-gp的转运底物多为天然杂环化疗药包括生物碱类（长春碱、长春新碱）、抗癌抗生素（阿霉素、柔红霉素、放线菌素D）、鬼臼霉素类、以及烷化剂丝裂霉素等 ［3］ 。P-gp的过度表达可通过调节鞘磷脂神经酰胺凋亡通路保护白血病细胞 ［4］ 。对白血病患者耐药研究还表明mdr1基因与P-gp的表达与白血病的发病年龄、疗效和预后等密切相关。Leith等 ［5］ 观察352例初诊AML患者中（中位年龄44岁），低于35岁的年轻患者mdr1表达占17%，50岁以上患者mdr1表达占39%。Tafu-ri ［6］ 发现mdr1过分表达提示预后不良，但无法预测CR持续时间及生存时间。List等认为CML急变期表达P-gp者预后不佳 ［7］ 。关于ABCC又称为MRP亚家族，成员包括ABCC1-ABCC12等12个基因。1992年Cole等从具有MDR表型但没有P-gp过度表达的人小细胞肺癌细胞中发现了一种新的耐药基因，命名为多药耐药相关蛋白（multidrug resistance protein，mrp）基因，该基因位于16q13.1上，其编码产物即为多药耐药相关蛋白（multidrug resistance protein1，MRP1），家族命名为ABCC1，其分子量为190kD，由1531个氨基酸组成，属于跨膜转运蛋白。MRP1存在于细胞膜上和内质网的质浆或高尔基体中，主要的生理功能为细胞内氧化剂的解毒作用。MRP1又称GS-X泵，是人们发现的第一个GS-X泵成员，体内的谷胱甘肽先与化疗药物以非共价结合形成GSH-S结合物（glutathione-S conjugate），然后由GS-X泵从ATP获能后将GSH-S结合物泵出细胞外或改变其在胞内的分布，实现对化疗药物的解毒作用。并转运阴离子两性化合物，如结合谷胱甘肽的药物衍生物，葡萄糖醛酸结合物，硫酸盐结合物（如vp-16、马法兰、柔红霉素、阿霉素、长春新碱）。MRP1与白血病患者的疗效、复发时间、生存率相关。MRP1在慢淋与前淋巴性白血病中（prolymphocytic leukemia，PLL）表达增高，有10%初治AML患者低表达 ［5］ ，于复发时高表达。Legrand等 ［8］ 报道MRPl与P-gp在AML患者共同表达时与DNR耐药明显相关，并且预示较差的治疗效果以及较短的生存期。与白血病耐药相关的ABCC亚家族其他成员中ABCC2与ABCC1结构功能很类似，具有转运GSH结合物的泵功能，它与顺铂和阿霉素耐药相关;ABCC2和ABCC3/MRP3与甲氨蝶呤耐药相关;ABCC4/MRP4与6-巯嘌呤和巯鸟嘌呤耐药有关;ABCC4在ALL中有表达，并且36%的ABCC5/NRP5与ABCC4有同源性，参与了ALL患者的巯嘌呤耐药性;Belinsky等 ［10］ 使用ABCC6/MRP6基因转染中国地鼠的卵巢细胞，发现表达ABCC6的细胞对替尼泊苷、依托泊苷、阿霉素和柔红霉素存在低度耐药现象。1998年Dolye等运用RNA指纹印迹技术从有耐药现象但无P-gp以及MRP表达的乳腺癌细胞MCF/Adrvp中发现了乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），家族命名为ABCG2。bcrp基因位于人染色体4q22，编码663个氨基酸的半转运ABCG2蛋白。ABCG2主要位于细胞膜上，通过跨膜传导通道对药物进行转运导致耐药。ABCG2的mRNA主要在胎盘和中脑区高表达，通过转运功能保护胎儿免受有毒物质损害和以药泵作用参与多药耐药，ABCG2过度表达对米托蒽醌、阿霉素、柔红霉素、拓扑特肯、SN-38等耐药。Ross等 ［11］ 用RT-PCR法对21例AL患者（20例AML，1例ALL）骨髓白血病细胞进行了测定，发现其中7例（33%）ABCG2mRNA高表达，且ABCG2的高表达和P-gp的高表达无明显相关性。Kolk等 ［12］ 用流式方法分析了20名初治以及复发/难治AML患者的ABCG2蛋白表达，AML患者呈低水平表达，加入ABCG2逆转剂fumitremorgin C（FTC）的样本较加入P-gp逆转剂PSC833和MK571的样本对米托蒽醌聚集浓度有轻微的上升。Abbott等 ［13］ 证实了相同观点。
2 中药逆转白血病多药耐药研究进展
由于中药的副作用小和取材方便，中药逆转ABC转运蛋白相关白血病多药耐药研究被日渐关注，逆转机制主要为增加细胞内化疗药物浓度、降低P-gp的表达、对mdr1mRNA表达水平的影响等。（1）生物碱类:如浙贝母碱、蝙蝠葛碱、苦参碱、粉防己碱、莲心碱、千金藤碱、异喹啉类生物碱等。李建华等 ［14］ 发现蝙蝠葛碱在非细胞毒性剂量下能提高白血病耐药细胞株K562/ADM内阿霉素的浓度，从而起到逆转K562/ADM多药耐药性的作用。李文瑜等 ［15，16］ 发现苦参碱可逆转白血病细胞K562/A02对柔红霉素的耐药性机制与下调mdr1mRNA的表达，同时伴有P-gp表达的下降有关。胡凯文等 ［17］ 发现浙贝母碱可以提高白血病耐药细胞株K562/A02和HL-60/Adr细胞内柔红霉素的浓度，亦降低P-gp的表达从而逆转耐药。田春艳等 ［18］ 发现异喹啉类生物碱中药MBC可以通过升高K562/ADN内药物的浓度来逆转耐药。（2）皂甙类:人参皂甙Rb1、雷公藤甙、三七甙、芍药甙、柴胡皂甙等可能有抗多药耐药作用。史曦凯等 ［19］ 应用MTT逆转试验发现人参皂甙单体Rb1可逆转K562/HHT的多药耐药，并呈剂量依赖性。（3）复方制剂:谢长生等 ［20］ 发现中药复方三根制剂可以逆转白血病细胞株K562/Adr和K562/Vcr的耐药，机制为提高细胞内阿霉素的浓度，并对阿霉素的外排有一定影响。（4）其它有效成分:如川芎嗪、汉防己甲素、冬凌草甲素、雄黄、榄香烯、多酚类的绿茶多酚和丹皮酚、柴胡注射液、康莱特注射液等。李建华等 ［21］ 发现川芎嗪能使K562/ADM对阿霉素和长春新碱的IC50降低，可使细胞内阿霉素和（或）柔红霉素的浓度升高，具有逆转白血病多药耐药性的作用。患者对临床应用川芎嗪有很好的耐受性 ［22］ ，无一例发生不良反应，同时能减少环孢菌素A的毒副反应，增强患者对该药的耐受性。敖忠芳等 ［23］ 通过MTT逆转实验发现汉防己甲素增加DNR对K562/A02细胞的毒性作用，仅部分患者出现轻度嗜睡及消化道反应。郭娟娟、张晨等 ［24，25］ 提出冬凌草甲素、雄黄可明显减小K562/A02细胞对的DNR、HHT的IC50，增加K562/ADM细胞内DNR的浓度，降低耐药倍数，下调P糖蛋白的表达。中药逆转剂的研究重点在于发现高效低毒药物。目前除逆转P-gp介导的耐药机制以外，对中药干预药物代谢、药物靶、DNA损伤修复、细胞凋亡等方面研究较少，由于体内试验及临床实验不多，存在着一定的局限性。随着研究的深入，相信中药在逆转白血病多药耐药等方面将会有良好的前景。
3 现代医学逆转白血病多药耐药研究进展
现代医学逆转ABC转运蛋白相关的白血病多药耐药中，针对P-gp的多药耐药逆转剂研究较为深入。目前报道有四代逆转剂:第一代逆转剂包括钙离子通道阻滞剂如维拉帕米、尼卡地平、尼非地平等;钙调蛋白抑制剂为三氟拉嗪;抗心律失常药如奎尼丁、普罗帕酮;抗疟药如奎宁和氯喹;雌激素拮抗剂如他莫昔酚以及免疫抑制剂环孢菌素A（CsA）等。这些药物多为疏水性化合物，较容易通过细胞膜;除环孢菌素A外，结构中都有1个在中性pH条件下带正电荷的氮原子。这些特点使它们能与P-gp即结合逆转耐药。但这些药物逆转耐药剂量之大而存在严重不可逆毒副反应，使应用受到限制。第二代逆转剂为右旋维拉帕米，MS209和PSC833等，其有效抑制P-gp的剂量时并不产生明显的毒副作用。第三代逆转剂如GF120918、LY335979、XR9576、R101933、OC1440935等，是一类具有新结构的药物。第四代逆转剂farnesy1蛋白转移酶抑制剂（farnesy1protein transferase inhibitors，FTIs），代表药物有SCH66336、R115777等，通过抑制转运蛋白ATP酶活性和通过影响P-gp底物结合区域影响对ATP的利用而逆转多药耐药 ［26］ 。最近的研究中，Knaust等 ［27］ 对36例AML患者（31例mdr1表达，26例初治，10例复发）的白血病细胞分组使用P-gp抑制剂CsA和代谢抑制剂（metabolic inhibitors，MI）后观察柔红霉素（DNR）的聚集和外排。结果表明CsA和MI都可以显著增加DNR的聚集，但MI的作用更明显。CsA在降低药物外排方面较MI更有作用，逆转药物细胞内聚集较研究耐药蛋白的表达更有意义，提示P-gp可能不是影响药物聚集最重要的因素。Lopes等 ［28］ 研究CsA和PSC833对鼠淋巴细胞白血病耐药细胞株LBR-V160（长春新碱耐药）和LBR-D160（阿霉素耐药）的耐药逆转作用，发现lug/ml的CsA能诱导凋亡LBR-V160和LBR-D160细胞株，表明CsA不但是mdr1的逆转剂，亦诱导白血病细胞凋亡，是否是一种潜在的抗白血病药物?对425例初治成人AML（15～60岁）使用奎宁进行三期临床试验 ［29］ 显著地提高了患者的CR率。在PSC833的三期临床试验时发现虽能抑制药物外排，显著提高了疗效，但化疗联用PSC833患者的死亡率却是未用者的2倍。除了公认的四代逆转剂以外，尚有其它一些新药亦能逆转耐药，如外周苯丙二嗪受体（peripheral benzo-diazepine receptor，pBzR）配体PK11195等 ［30］ ，有望可从实验研究进入临床。抑制mdr1基因表达使P-gp介导的耐药受抑，是从基因水平逆转MDR的研究。包括应用mdr1基因的反义寡核苷酸片段封闭mdr1基因的转录，将反义寡核苷酸片段和反义RNA导入肿瘤细胞，反义RNA与mdr1基因的mRNA形成二聚体抑制mRNA翻译，阻断mdr1基因的表达，减少了P-gp合成等。使用表达核酶的逆转录病毒载体转染表达mdr1基因的细胞后，核酶的剪切功能序列的切割mdr1mR-NA，可有效抑制mdr1基因的表达。RNA干涉机制是基因的监察者，它可以利用特定结构的RNA来关闭特定的基因，起到保护细胞免受有害基因的影响，并且在细胞的生长发育中调节正常基因。也有报道利用RNA干涉来阻止mdr1mRNA的表达以逆转耐药。经典的白血病耐药逆转剂对BCRP无作用，BCRP高表达导致的耐药可被Fumitremorgin C（FTC）所逆转 ［31］ 。由于FTC是烟曲霉菌毒素，从烟曲霉菌分泌物中提取而来，故不能逆转P-gp或MRP介导的耐药细胞，但可以提高米托蒽醌、阿霉素、拓扑特肯等药物在细胞内的聚集。FTC也可与米托蒽醌、阿霉素竞争性结合BCRP的转运位点，抑制药物转运而逆转耐药。Allen等报道 ［32］ P-gp逆转剂GF120918可以逆转BCRP所致的耐药，使拓扑特肯的生物利用度增加。此外，米托蒽醌耐药细胞株MCF7/MX中发现的野生型BCRP也可通过降低细胞内药物聚集对甲氨蝶呤产生耐药，并可被GF120918逆转 ［33］ 。
4 结语
白血病的多药耐药机制复杂，选用针对某一机制的逆转剂可能难以达到预期效果。在ABC转运蛋白超家族中与耐药的作用最明确的蛋白是P-gp、MRP1、BCRP。对多药耐药的研究要争取达到2个目的:一是使肿瘤细胞失去由mdr1、MRP等介导的多药耐药基因，二是需利用这种耐药机制保护对化疗敏感的非肿瘤细胞，选择有效的抗多药耐药方案。预计中西药结合抗多药耐药是很有前景的。
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（编辑晓 青）
基金项目:江苏省卫生厅、扬州市科技局资助课题（项目编号:Z200116、YZ2002026）
作者单位:225001江苏省扬州大学第一临床医学院