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【摘要】 目的 了解WT1基因（Wilms’tumor gene）与急性白血病缓解后微小残留病灶的关系。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测了急性白血病（AL）及慢性粒细胞白血病(CML）中WT1基因不同剪接体的表达情况。结果 AL中WT1基因阳性表达率为50%， CML中WT1基因阳性表达率为40%，正常人无WT1基因表达，WT1基因4种剪接体的表达水平相近。结论 WT1基因在白血病中呈较高表达，其结果可作为白血病残留病灶检测的指标。
【关键词】 急性白血病；WT1基因；微小残留病灶
Molecular biological measurement of minimal residual disease in patients with acute leukemia after complete remission
CHEN Yan，LI Jing-lan.
Department of Internal Medicine，Huanhu Hospital of Tianjin,Tianjin 300060，China
【Abstract】 Objective Expression of the Wilms’tumor gene(WT1)was studied in patients with acute leukemia after complete remission.Methods By using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR),the expression of WT1 gene in patients with acute leukemia and chronic myeloid leukemia were detected.Results The positive expression rate of WT1 gene was 50.0% in patients with acute leukemia（AL）.The positive expression rate of WT1 gene was 40.0% in patients with chronic myeloid leukemia（CML）.WT1 gene was not detected in normal control.The positive rate of WT1 gene’s splice variant in AL were different,but these had not significantly different each other.Conclusion WT1 gene is frequently expressed in leukemia,it would be a useful marker for the detection of minimal residual disease(MRD) in leukemia.
【Key words】 acute leukemia；WT1 gene；minimal residual diseAse
WT1基因是由于对遗传性肾胚胎肿瘤（Wilms’ tumor）的分子遗传学研究而发现的。1990年Call等克隆了此相关基因的cDNA，命名为Wilms’瘤基因I(WT1)［1］。WT1基因通过两种可变剪接形式产生4种mRNA剪接体［2］。第一种可变剪接体为第5外显子中51bp(剪接变体Ⅰ)，编码17个氨基酸的片断；第二种可变剪接体为第9外显子中9bp(剪接变体Ⅱ)，编码由赖氨酸-苏氨酸-丝氨酸（KTS）组成的氨基酸片断。经不同剪接WT1基因可产生4种长约3.5Kb的mRNA，4种剪接体分别是：(1)无剪接变体存在;(2)仅存在剪接变体Ⅰ；(3)仅存在剪接变体Ⅱ；(4)两种剪接变体均存在。新近研究发现WT1基因在多种类型急性白血病中有异常的高表达，而在正常骨髓及外周血中表达很低或不表达［3，4］。笔者根据WT1两种剪接变体存在与否设计引物，应用RT-PCR方法检测了处于急性白血病（AL）不同病程的患者WT1基因表达的情况，试图揭示WT1基因不同剪接体与AL不同病程的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择天津市第一中心医院收治的住院及门诊患者52例。其中AL 42例：初治组16例，其中AML（急性髓细胞白血病）11例，ALL(急性淋巴细胞白血病)5例，平均年龄37.6岁（4～67岁）；复发组11例,其中AML 9例，ALL 2例，平均年龄33.6岁（10～49岁）；完全缓解（本文中完全缓解的概念是指骨髓象达到完全缓解的标准）组15例，其中男7例，女8例，平均年龄39.2岁（12～67岁）。 CML 10例，男5例，女5例，平均年龄49.6岁（29～78岁）。对照组：14例正常健康人为对照组，男6例，女8例，平均年龄 46岁（22～63岁）。以K562细胞株作为阳性对照。
1.2 方法
1.2.1 血中单个核细胞的分离及RNA的提取 取3ml外周血，用肝素抗凝。经裂解液裂解细胞后，采用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法［5］提取细胞总RNA，-80℃保存。RNA质量检测：样品OD260/OD280比值在1.8～2.0之间,可行逆转录反应。
1.2.2 逆转录实验 反应程序：在PE-2400型PCR仪中进行，42℃ 2min后加入M-MLV 25℃ 10min、37℃ 60min、95℃ 5min后冷却至4℃。
1.2.3 PCR反应 反应程序：在PE-2400型PCR仪中进行，PCR的变性、复性、延伸的温度和时间：94℃ 2min后加入Taq酶 94℃ 0.5min、54℃ 1min、72℃ 1min，共35个循环后72℃ 10min，冷却至4℃保存。
1.2.4 引物设计 见表1。
1.2.5 凝胶电泳 在3%的琼脂糖凝胶上以恒压方式电泳，电压60V(电压降为5V/cm)，60min。在紫外透射仪上观察所扩增的电泳带，并照相纪录。所用PCR Marker为DL2000：2000、1000、750、500、250、100bp。
1.2.6 酶切反应 反应程序：37℃ 120min，72℃ 15min后冷却至4℃。酶切产物3%琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪上观察所扩增的电泳带，并照相纪录。
表1 引物设计
1.3 统计学方法 结果用平均数表示，采用χ2检验，以P＜0.05为有显著的统计学意义。
2 结果
2.1 正常人及造血系统各种肿瘤WT1基因表达 在AL、CML中WT1基因表达与正常对照组比较，差异均有统计学意义。AL初治、复发及缓解患者中WT1基因阳性率的比较，初治组与复发组相比较，差异无统计学意义；初治组与缓解组相比较，差异有显著的统计学意义。CML慢性期与急变期相比较，差异有显著的统计学意义。见表2。
应用卡方检验，AL组与健康对照组相比较P=0.0004,差异有统计学意义。AL中初治组与复发组相比较P=0.313, 差异无统计学意义；初治组与缓解组相比较P=0.041，差异有统计学意义。CML慢性期与急变期相比较P=0.018，差异有统计学意义，加速期与急变期相比较P=0.400，差异无统计学意义。
表2 血液系统恶性肿瘤患者与正常对照组
2.2 WT1基因各剪接体在AL及CML急性变期中的表达 见表３。
表3 WT1基因各剪接体在AL及CML急性变期中的表达
应用卡方检验,WT1基因的4种剪接体在各种疾病的组间两两比较P＞0.05, 差异无统计学意义；4种剪接体在各种疾病中阳性例数的合计数两两比较P＞0.05，各组间的差异无显著的统计学意义。
2.3 WT1基因在K562细胞株中表达 呈阳性表达,且4种剪接体均有表达。
3 讨论
WT1基因最先被认为是一种肿瘤抑制基因，近来研究发现WT1基因在白血病细胞中高度表达，并与白血病的发生、发展及预后有关。1992年Miwa等［6］用Northern印记方法首先证实了44%的急性淋巴细胞白血病及68%急性髓细胞白血病中有WT1基因表达，近来一些学者也相继报道WT1基因在白血病细胞株，如K562、HL60、KG1等及白血病患者中有异常的高表达，并发现恶性组织细胞病和骨髓增生异常综合征也有WT1的表达［3，4］。而在正常骨髓细胞及外周血中不表达或表达极低水平的WT1基因（分别为10-3-10-4，10-5）［7］。目前，尚未见国内外有研究白血病中WT1的4种剪接体表达情况的报道，本实验根据WT1存在剪接变体来设计引物，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定不同类型白血病及其处于不同疾病阶段的患者WT1基因的表达，初步探讨了WT1基因表达与白血病的关系及其意义，以及WT1基因4种不同的剪接体在白血病中的表达情况。本研究发现WT1基因在急性白血病初治组和复发组中的阳性率较高，分别为62.5%和63.6%，治疗达完全缓解后WT1基因的阳性率为26.7%，提示WT1在AL初治组中的阳性率显著高于缓解组，结果与文献报道一致［3，4，6，7］。因此，WT1基因的检测可以作为急性白血病检测的一个有效手段。在慢性髓细胞白血病的慢性期未发现WT1基因的表达，在加速期及急变期WT1表达阳性。
本实验发现WT1基因的4种剪接体在各种疾病的组间两两比较P＞0.05,差异无显著的统计学意义。4种剪接体在各种疾病中阳性例数的合计数两两比较，各组间的差异无显著的统计学意义。此结果与Haber等［8］发现在正常肾脏中4种剪接体之比为A∶B∶C∶D=1.0∶2.5∶3.8∶8.3的结果不相符，显示WT1基因的4种剪接体在白血病中的阳性率差异不显著，表达情况与正常肾脏及Wilms’瘤中不同，也提示WT1基因在白血病的发病机制中可能与其在Wilms’瘤中的作用有所不同，可扩大样本以进一步研究。
总之，本研究发现WT1基因在白血病中均有不同程度的表达，随着疾病的进展其阳性表达率逐渐增高，WT1基因可作为血液系统恶性疾病诊断及估计预后的指标。
【参考文献】
1 Call KM,Glaser T,Ito CY,et al.Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms’tumorlocus.Cell,1990，60:509.
2 Daniel A Haber,Park S,Maheswaran S,et al.WT1-Mediated growth suppression of Wilms tumor cells expressing a WT1 splicing variant.Science,1993，262:2057-2059.
3 Bergmann L,Miething C,Maurer U,et al.High levels of Wilms’tumor gene (wt1) mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse long-term outcome.Blood,1997，90:1217-1225.
4 上海市白血病协作组.WT1基因在白血病患者中的表达.中华内科杂志，2000，5：295-298.
5 Gao L,Bellantuono I,Elsasser A,et al.Selective elimination of leukemic CD34+progenitor cells by cytotoxic T lymphocytes specific for WT1. Blood，2000，95:2198-2203.
6 Miwa H,Beran M,Saunder GF.Expression of the Wilms’tumor gene (WT1)in human leukemias.Leukemia，1992，6:405-409.
7 Inoue K,Ogawa H,Sonoda Y,et al.Aberrant overexpression of the Wilms’tumor gene (WT1) in human leukemia.Blood,1997，89:1405-1412.
8 Haber A,Sohn L,Buckler J,et al.Alternative splicing and genome structure of the Wilms tumor gene WT1.Pro Natl Acad Sci.USA，1991，88:9618-9622.
作者单位： 300060 天津，天津市环湖医院神经内科
(编辑：苜 紫)