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【摘要】 目的 探讨载脂蛋白E（apoE）基因多态性与轻度认知障碍（MCI）的关系。方法 应用限制性片段长度多态分析-聚合酶链反应（RFLP-PCR）方法，测定56例MCI患者和89例同龄对照组apoE基因型和等位基因频率。结果 MCI组ε2、ε3、ε4等位基因频率分别为7.14%、71.38%和21.48%，而同龄对照组分别为7.30%、84.83%和7.87%。apoEε4等位基因在MCI患者中出现的频率明显高于对照组，统计学分析说明差异具有非常显著性（P<0.01）。结论 apoEε4等位基因是MCI的危险因素。
【关键词】 轻度认知障碍；多态性；载脂蛋白E；基因型
An association analysis of apolipoprotein E genotypes with mild cognitive impairment
YE Ni,ZHANG Lin-hong.
Department of Neurology,The Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430014，China
【Abstract】 Objective To analyse the association of apolipoprotein E(apoE) genotypes with mild cognitive impairment(MCI).Methods RFLP-PCR technology is applied to analyse the apoE allele frequency of 56 MCI patients and 89 controls.Results Among the 56 cases of MCI,the frequency of apoEε2,ε3,ε4 are 7.14%,71.38%,21.48% respectively,while in the 89 controls they are 7.30%，84.83%，7.87% respectively.The frequencies of the two groups have significant difference(P<0.01)and the frequency of apoEε4 allele is higher in MCI than that in the controls and the statistical treatment suggest that there is significant difference（P<0.01）.Conclusion The apoEε4 allele is a genetic risk factor of MCI.
【Key words】 mild cognitive impairment;polymorphism;apolipoprotein E;genotypes
轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）特指有轻度记忆或认知损害、但无痴呆的老年人，其病因不能由已知的医学或神经精神病状况解释。目前普遍认为MCI是介于年龄相关性记忆损害（age-associated memory impairment，AAMI）和老年性痴呆（Alzheimers disease，AD）之间的一种综合征。许多资料表明：MCI患者进展为AD（主要指散发性AD）的年转化率是同龄认知功能正常老年人的10倍，识别MCI患者将有助于早期干预和治疗，所以MCI相关研究成为近年来国内外的热门话题。
近年来，越来越多的研究发现多个基因，如淀粉样蛋白前体（APP）基因、早老素-1（PS-1）基因、早老素-2（PS-2）基因、载脂蛋白E（apoE）等位基因和低密度脂蛋白受体相关蛋白基因等遗传因子在调控AD病理和生化异常代谢中起着重要作用。其中，位于19号染色体的apoE基因是资料与目前唯一广泛得以认同的与散发性AD和迟发性家族性AD相关的基因。本研究旨在探讨apoE基因多态性与MCI之间的关系，为MCI易进展为AD寻找遗传学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 研究对象源自武汉市中心医院2002年7月~2003年6月神经内科和干部四科门诊和病房，所有对象的文化程度均在中学及以上，分为MCI组和对照组。MCI组56例，男23例，女33例；年龄61~89岁，平均（70.12±7.24）岁。依据1997年Peterson等确立的诊断依据确定MCI组入选标准如下：（1）有记忆力减退的主诉；（2）检查时证明有轻度记忆损害；（3）没有或很少有其他认知损害；（4）日常生活活动正常（BI指数≥95分）；（5）满足CDR=0.5的标准；（6）MMSE评分≥24分，但≤27分；（7）不够NINDS-ADRDA或DSMⅢ-R对痴呆的标准。排除标准：（1）昏迷；（2）失语和（或）精神异常（如抑郁、谵妄）而不能配合量表检查者。
对照组89例，男46例，女43例；年龄60~88岁，平均（69.47±8.02）岁。均符合下述入选标准：（1）无记忆力减退的主诉；（2）检查时排除认知缺损、CDR=0；（3）日常生活活动正常；（4）MMSE评分＞27分；（5）年龄、性别、受教育程度、既往高血压、糖尿病、心脏病及卒中史均与MCI组匹配。对照组和MCI组在年龄上差异无显著性（P>0.05）。
1.2 研究方法
1.2.1 基因学检查 用PCR-RFLP方法测定apoE基因型。实验步骤如下：（1）空腹12h后，取肘静脉血5ml，EDTANa2抗凝，用酚:氯仿抽提白细胞中的DNA，使纯度达到A280/A260>1.8；（2）PCR扩增目的基因片段：参照文献［1］，引物设计如下：上游引物为5’-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’和5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3’。扩增体系为50μl。PCR的条件为95℃变性5min，之后35次循环（94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min），72℃继续延伸10min后降至4℃，用1.6%琼脂糖凝胶电泳待测扩增产物；（3）限制性片段长度多态性（RFLP）分析：取10μl PCR产物，加10u HhaI内切酶消化，37℃酶切4h，非变性聚丙烯酰胺浓度为0.1g/L，交联度为49∶1，取5μl酶切产物，加等体积的甲酰胺变性液，在电压100~200V，温度20℃条件下，电泳5h左右；（4）银染：电泳结束后，用乙酸固定，纯水洗，银染液染色（1.4g/L，AgNO3和甲醛），纯水洗，加显色液（30g/L，Na2CO3，甲醇400μg/L，Na2S2O3）显色，乙酸终止反应，根据电泳带型确定apoE基因型。拍片。
1.2.2 统计学分析 使用SPSS 10.0处理数据，计算各等位基因和基因型频率的分布，基因频率采用Hardy-Weinberg遗传平衡式计算。两组的apoE基因型或等位基因频率比较采用卡方检验。
2 结果
2.1 PCR扩增产物和HhaI酶切PCR扩增产物电泳结果 ApoE基因的PCR扩增片段大小为244bp，经HhaI酶切后，ε2型酶切产物的主要片段为91bp/83bp；ε3型酶切产物的主要段为91bp/48bp/35bp；ε4型酶切产物的主要段为72bp/48bp/35bp。即可根据apoE PCR产物酶切后的片段长度来判断其等位基因情况（见图1）。
图1 apoE PCR产物经HhaI酶切后的PAGE电泳（略）
M：pBR3221HaeIII marker;标本1的apoE基因型为ε4/ε4；标本2、4、7为ε3/ε3；标本3为ε2/ε4；标本5、6为ε3/ε4；标本8为ε2/ε3
2.2 apoE基因型和等位基因频率分析 MCI组和对照组的基因型和等位基因频率结果，见表1。结果显示MCI组和对照组的纯合子基因型均以ε3/ε3型最多（分别为55.36%和71.91%），ε4/ε4型最少（分别为3.67%和1.12%），未检出ε2/ε2型；MCI组的杂合子基因型以ε3/ε4型最多（26.69%），ε2/ε4型次之（8.92%），ε2/ε3型最少（5.36%）；对照组的杂合子基因型以ε2/ε3型最多（13.48%），ε3/ε4型次之（12.37%），ε2/ε4型最少（1.12%）。等位基因中ε3频率最高（MCI组和对照组分别为71.38%和84.83%），ε4次之（分别为21.48%和7.87%），ε2最少（分别为7.14%和7.30%）。组间比较显示：两组apoE基因型分布总体比较其差异在统计学上差异有非常显著性（χ2=10.52，P<0.01）；基因频率总体比较差异有显著性（χ2=7.48，P<0.025）。
表1 MCI组和对照组apoE基因型和等位基因频率分布 （略）
注：与对照组比较，▲P<0.05；★P<0.01；☆P>0.05
在MCI组和对照组中比较携带ε4的数目（ε2/ε4、ε3/ε4、ε4/ε4）和没有携带ε4的数目（ε2/ε3、ε3/ε3），差异也具有非常显著性（χ2=10.41，P<0.01），见表2。
表2 MCI组和对照组apoEε4等位基因分布 （略）
注：*表示任一非ε4的等位基因（如ε2、ε3）
分别对apoE 3种等位基因频率进行组间卡方检验，见表3，结果显示：MCI组的ε4频率较对照组显著升高（P<0.02）；MCI组的ε3频率低于对照组（P<0.05），似乎暗示ε3对认知功能具有保护作用；ε2频率虽低于对照组，但其差异无显著性（P>0.05）。
3 讨论
人类的apoE由19q11.2所编码，其基因常见有3种表型，即ε2、ε3和ε4等位基因所编码的3种载脂蛋白E2、E3和E4，构成6种不同的基因型，包括3种纯合子（ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4）和3种杂合子（ε2/ε3、ε3/ε4、ε2/ε4）。研究显示：最常见的等位基因是ε3，而ε4作为AD的高危因子和易患基因由Strittimatten等［2］于1993年首先报道。针对MCI患者的多个研究表明ε4携带者进展为AD的危险性增加。其中Peterson［3］认为apoE基因型是MCI转化为AD的最佳预言因子，而Tierney等［4］则认为该预言模式必须结合记忆检测才可靠。
表3 apoE各等位基因与MCI相关性的卡方检验（略）
注：OR：比值比；CI：可信区间
3.1 MCI患者的apoE基因多态性 apoEε4基因型是目前明确的与散发性AD相关的第一个遗传易感因子。鉴于MCI向AD的高转化率，apoE基因多态性成为MCI相关研究的热点之一。在本研究中，与对照组比较，MCI组ε3/ε4型增多，ε3/ε3型减少，在统计学上其差异有非常显著性（χ2=10.52，P<0.01）；MCI组ε4等位基因频率高达21.48%，远远高于对照组（7.87%，P<0.01）。我们回顾了相关文献：Bartres-Faz等［5］比较了AAMI和MCI个体的基因差异后发现：MCI组的ε3/ε4型增多，ε3/ε3型减少，而AAMI组在剔除MCI个体之后的apoE基因型与对照组比较无差异。心血管卫生研究认知组（CHSCS）［6］亦证实了apoEε4等位基因与记忆型MCI（aMCI）相关。对比利时人中MCI患者的研究也发现apoEε4和MCI之间存在着肯定的关联——尽管MCI是一综合征，但ε4基因频率增加预示着MCI向AD进展的高倾向性［7］。从上述研究数据不难看出：apoE基因多态性与MCI发病有关，ε4基因可能是MCI的危险因子，这与本研究的结果是一致的。而apoEε4作为AD和MCI共同的遗传易患因子，也暗示了MCI之所以易进展为AD（尤指散发性AD）可能具有遗传学基础。
3.2 apoE在MCI中的作用及其可能机制
3.2.1 apoE与β类淀粉样蛋白（Aβ）沉积 Aβ是老年斑（SP）的核心成分，其毒性作用导致神经轴突变性。目前认为Aβ的积聚反应有两个过程：首先是匀速的核反应过程，该过程主要与Aβ42有关；其后是Aβ40和Aβ42共同参与的快速延长反应。利用识别Aβ40、Aβ42的两种抗体进行免疫组化染色研究发现：Aβ40染色在apoEε2、ε3、ε4顺次增强，Aβ42染色则不随之改变，提示apoEε4与Aβ40有密切关联，可促进作为淀粉样蛋白伸长分子的Aβ40在脑内的积聚，也说明了apoEε4只对AD晚期发病有影响，可加快发病的速度［8］。
3.2.2 apoE与神经元纤维缠结（NFT） apoEε3可与tau蛋白结合，apoEε4则不能。对apoE基因敲除小鼠的研究表明：apoEε3或ε2借助自身的半胱氨酸残基与tau结合，防止后者被过度磷酸化而形成双螺旋体（PHF）样结构；而apoEε4的半胱氨酸含量明显低于ε3和ε2，从而使tau易被磷酸化，形成PHF，不能维持正常的微管结构和功能［9］。因此，亦有学者认为：促进NFT形成的因素是apoEε3或ε2的缺失，而不是apoEε4的存在。
3.2.3 apoE与神经突触损伤的修复 中枢神经突触受到损伤后代偿性地出现局部星型胶质细胞合成apoE增加。这时，apoE表达的增加及LDL受体结合力的增高是同步的，损伤区的游离胆固醇通过胆固醇-apoE-LDL受体复合物的形式完成转运和再利用。但因为apoE4与LDL受体结合力强，阻碍了其转运胆固醇的作用。此外，apoE还直接影响神经突起的生长，但不同apoE亚型作用差别很大：apoE3促进神经突起延伸，同时分支减少；apoE4则使突起延伸和分支均减少。apoE的这种作用类似于神经营养因子。而apoE基因敲除小鼠的中枢神经元随鼠龄的增加显现明显的树突内细胞骨架崩解和突触丧失。
3.2.4 apoE与慢性脑缺血 新近研究表明：慢性脑缺血与伴发于包括血管性痴呆、AD等在内的多种以认知功能障碍为早期主要表现的疾病病理过程中，并认为慢性脑缺血是多种类型痴呆的重要危险因子。颈内动脉粥样硬化则是慢性脑缺血的主要原因。apoEε4通过影响脂代谢起着致动脉粥样硬化的作用。与E2相比，E4与LDL受体的结合能力较强，使CM和VLDL残粒代谢加速，IDL向LDL转化增多，致使血浆中CM残粒、VLDL和IDL水平下降，而LDL水平升高；此外，ε4基因还有升高apoB和降低HDL-C的作用。所以ε4基因可通过调节这些脂蛋白和载脂蛋白的水平发挥致动脉粥样硬化的作用［10］。
3.3 ε4基因测定对MCI患者的意义 虽然有众多的资料显示MCI患者具有向AD的高转化率，但并非所有的MCI患者均会转化为AD，这促使人们寻找导致MCI异质性的可能因素，即进展型MCI的最佳预言因子，ε4基因测定可能有助于早期识别进展型MCI患者，并积极治疗干预。当然，apoE基因多态性对认知功能的影响尚不十分清楚，并且PS1、PS2、APP基因、apoE受体蛋白基因以及LDL-R相关蛋白对这一过程亦具有复杂的调节作用，所以过分强调apoEε4的作用并不恰当。
本文结果显示apoEε4等位基因与MCI的发病密切相关。虽然它尚不能作为MCI诊断的特异性生物学指标，但是apoE基因型分析可作为临床医师估计MCI向AD转化的预测因子。当然，为了得到更明确的资料，需要今后进行大样本、多中心的对照研究。
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（编辑：商 洁）
作者单位： 430014 湖北武汉，武汉市中心医院神经内科