ERK1/2信号通路对T淋巴细胞的影响

    ERK1/2信号通路对T淋巴细胞的影响 (pdf) 

   ［摘要］  细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2)是将信号从细胞表面受体传导至细胞核的关键。磷酸化的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导NF-AT、AP-1、NF-κB等转录因子的活化，参与细胞多种生物学反应。近年来研究发现，ERK1/2信号通路的激活能促进T淋巴细胞的活化、增殖并抑制其凋亡，这可能为T淋巴细胞相关的免疫性疾病和肿瘤的治疗提供了新的策略。

    ［关键词］   细胞外信号调节激酶1/2；信号通路；T淋巴细胞；活化；增殖；凋亡

      丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)普遍存在于低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，且具有生物进化的高度保守性。MAPK信号通路能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起多种生物学反应。目前已发现多条并行的MAPK信号通路如ERK1/2、p38、JNK等，其中ERK1/2信号通路被认为是经典的MAPK信号通路。近年来发现，ERK1/2信号通路的激活能促进T淋巴细胞的活化、增殖并抑制其凋亡。

    1  ERK1/2信号通路的生物学特点

    ERK1/2是由Boulton等在20世纪90年代初期先后分离鉴定出的一种蛋白激酶，分子质量分别为44 kD和42 kD，它们有90%的同源性，在结合底物的中心区有更高的表达，但在组织中的相对含量有所差异［1］。目前对ERK1/2信号通路的激活过程及生物学意义已有了较深入的认识，ERK1/2信号通路的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核内的关键,参与这一转导过程的有GTPase、Ras、Raf-1、丝/苏氨酸激酶和MEK1/2双特异性激酶等；ERK1/2信号通路是由一个小GTP蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白组成的级联反应，其活化的中心是使Ras进行鸟苷酸交换变成其活化形式RasGTP，并需要Ras、Raf-1蛋白参与。PD98059和U0126是ERK1/2信号通路的特异性抑制剂，它们可以通过抑制MEK1/2的活性阻止ERK1/2的磷酸化，从而起到阻断ERK1/2信号通路的作用。平时ERK1/2位于胞浆内，一旦被激活，ERK1/2迅速穿过核膜并通过磷酸化反应调节某些转录因子的活性如NF-AT、AP-1、NF-κB等，这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录，引起特定蛋白的表达或活性改变，最终调节细胞代谢和功能并影响细胞产生特定的生物学效应［2］(见图1)。

    2  ERK1/2信号通路对T淋巴细胞的影响

    2.1  ERK1/2信号通路对T淋巴细胞活化的影响  CD69、CD25是T淋巴细胞活化的标志，Okamoto等［3］用12.5 μmol/L U0126和50 μmol/L PD98059处理人的外周血T细胞，抗CD28抗体刺激3天，CD25-FITC单抗和CD69-PE单抗染色，流式分析表明，U0126和PD98059较对照组均能明显减少CD69、CD25的表达。Dumont等［4］用37 μmol/L PD98059处理人的T细胞，1 ng/ml PMA刺激14 h，CD69-PE单抗染色，流式分析表明，PD98059较对照组能阻止ERK1/2的磷酸化，并能部分抑制CD69的表达。CD43分子是一个重链跨膜糖基化蛋白，常表达在造血细胞表面，用抗CD43单抗L10孵育Jurkat细胞，结果发现CD69的表达上调，而用PD98059预处理后，CD69的表达减少50%，提示ERK1/2信号通路的激活促进CD43分子介导的Jurkat细胞的活化［5］。T淋巴细胞活化时能大量分泌IL-2。HughesFulford等［6］用5 μg/ml ConA刺激JurkatE6-1细胞，收集细胞裂解物，Western blot检测发现，与对照组相比，刺激组有明显的ERK1/2磷酸化，进一步用10 μmol/L U0126处理Jurkat E6-1细胞，再用PMA刺激，结果显示U0126阻止IL-2、IL-2Rα的蛋白合成分别减少99%、94%，以上结果说明JurkatE6-1细胞的活化由ERK1/2信号通路所介导。另有研究认为，ERK1/2信号通路不影响T淋巴细胞的活化，Koike等［7］用25 μmol/L PD98059处理脾脏纯化的T细胞，抗TCR抗体刺激，结果显示，PD98059较对照组仅能轻微影响CD69、CD25的表达。Barata等［8］用10 ng/ml IL-7刺激急性淋巴细胞性白血病T细胞(acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)，流式检测发现IL-7能上调CD69的表达，而用PD98059预处理后不影响CD69的表达，这表明ERK1/2信号通路不能影响IL-7介导的T-ALL的活化。可见，多数研究表明ERK1/2信号通路的激活能促进T淋巴细胞的活化。

    2.2  ERK1/2信号通路对T淋巴细胞增殖的影响  Sharp等［9］用25 μmol/L PD98059处理CD4+淋巴结T细胞，10 ng抗CD3抗体刺激3天，［3H］胸苷掺入法检测，结果发现25 μmol/L PD98059可使T细胞增殖减少14%，用17.5 μmol/L PD98059处理小鼠的胸腺细胞，PMA刺激3天，［3H］胸苷掺入法检测，结果发现PD98059能有效抑制胸腺细胞的增殖。Dumont等［4］用PD98059处理纯化的T细胞，抗CD3抗体刺激3天，［3H］胸苷掺入法检测发现，PD98059能抑制T细胞增殖。Mariathasan等［10］用12.5  μmol/L和25 μmol/L PD98059处理纯化的CD8+ P14RAG2-/-胸腺细胞，再与p33脉冲的脾脏细胞共育，结果显示，与对照组相比，PD98059使胸腺细胞增殖分别减少30%和55%，这表明ERK1/2信号通路的激活能够促进TCR介导的胸腺细胞增殖。T激肽原能抑制Jurkat细胞增殖，AcunaCastillo等［11］用Con A刺激Jurkat细胞，结果表明ERK1/2磷酸化在15 min时达到最高，而T激肽原处理后能明显降低ERK1/2的激活，这表明T激肽原对Jurkat细胞的增殖抑制可能与ERK1/2信号通路有关。另有研究认为，ERK1/2信号通路不影响T淋巴细胞的增殖，Nekrasova等［12］用OVA抗原肽免疫ERK1-/-小鼠的淋巴结T细胞10天，［3H］胸苷掺入法检测发现，ERK1-/-小鼠淋巴结T细胞的增殖与正常小鼠相似，进一步用抗CD3抗体刺激ERK1-/-胸腺细胞48～72 h，结果表明，ERK1-/-胸腺细胞的增殖与正常小鼠相似，这表明ERK1缺陷并不影响T细胞的增殖。TAIL7细胞属于T-ALL细胞系，Barata等［8］研究发现IL-7能诱导TAIL7细胞增殖，而用10 μmol/L PD98059预处理TAIL7细胞，10 ng/ml IL-7刺激72 h，［3H］胸苷掺入法检测发现，PD98059对TAIL7细胞的增殖无影响。可见，多数研究表明ERK1/2信号通路的激活能促进T淋巴细胞的增殖。

    2.3  ERK1/2信号通路对T淋巴细胞凋亡的影响  Yu等［13］用抗肿瘤药氟拉达滨(Fludarabine)和PI3K通路的抑制剂LY294002联合处理Jurkat细胞，结果导致细胞色素c的释放，并明显削弱ERK1/2的激活，而分别用空载体pcDNA3.1和持续激活ERK1/2的pcDNA3.1载体转染Jurkat细胞，结果发现Fludarabine和LY294002联合处理Jurkat细胞的凋亡完全被增强表达的ERK1/2抑制，可见ERK1/2信号通路的激活可保护药物联合诱导的Jurkat细胞免受凋亡。Islam等［14］用1 mg/kg LPS预先致敏小鼠，12.5 mg/kg DON强饲，琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测，结果发现DON能诱导胸腺细胞DNA断裂和凋亡，同时Westernblot分析显示，ERK1/2的磷酸化被抑制，这表明ERK1/2信号通路可能与DON诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡有关。一磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate，S1P)能抑制Fas诱导的Jurkat细胞凋亡，用PD98059和U0126分别处理Jurkat细胞，50 ng/ml抗Fas抗体刺激5 h，荧光显微镜观察显示，PD98059和U0126均能强烈抑制S1P的抗凋亡作用，这表明ERK1/2信号通路的激活能增强S1P对Jurkat细胞的凋亡抑制［15］。另有研究认为，ERK1/2信号通路不影响T淋巴细胞的凋亡，Barata等［8］用10 μmol/L PD98059处理TAIL7细胞，再用10 ng/ml IL-7刺激96 h，AnnexinVFITC染色，流式分析表明，与对照组相比，PD98059对TAIL7细胞的凋亡无影响。相反的结果也见报道，Wispriyono等［16］将Jurkat细胞与20 μmol/L五氯酚的代谢产物TCHQ共育，流式检测发现TCHQ能引起Jurkat细胞明显凋亡，同时ERK1/2的磷酸化也提高，而加入50 μmol/L U0126则能明显抑制TCHQ诱导的Jurkat细胞凋亡，这表明ERK1/2信号通路的激活能促进TCHQ诱导的Jurkat细胞凋亡。可见，多数研究表明ERK1/2信号通路的激活能抑制T淋巴细胞的凋亡。

    3  ERK1/2信号通路对T淋巴细胞影响的分子机制

    研究发现，ERK1/2信号通路对T淋巴细胞活化、增殖、凋亡的影响可能是通过其通路上的转录因子来实现的。LiWeber等［17］用抗CD3单抗刺激外周血T细胞，Westernblot分析显示，转录因子AP-1、cFos和cJun高表达，而经UV照射后均被抑制。同时，UV能迅速抑制ERK1/2的磷酸化，提示ERK1/2信号通路可能通过对转录因子的调节来影响UV对T细胞的活化。Manjul等［18］将印度没药粗提物与PHA诱导的PBMC共育，结果发现PBMC的增殖较对照组明显被抑制，用10 ng/ml PMA和0.5 μmol/L Ion刺激印度没药粗提物处理过的PBMC，结果发现，与对照组相比，ERK1/2的磷酸化减少，同时AP-1、cJun、cFos的水平明显下调，提示ERK1/2信号通路可能通过转录因子的调节抑制PBMC的增殖。Fas诱导的细胞凋亡是经由Caspase-8的激活，研究发现，在人的T淋巴细胞中，Caspase-8的抑制剂FLIP不仅能抑制T淋巴细胞凋亡，而且能激活ERK1/2和NF-κB，提示ERK1/2和NF-κB可能掺入了Fas诱导的T淋巴细胞凋亡［19］。近年来研究表明，ERK1/2信号通路中的转录因子NF-AT、AP-1和NF-κB对T淋巴细胞的影响较明显。

    3.1  NF-AT与T淋巴细胞  Varga等［20］用50 μmol/L PD98059处理EL-4胸腺细胞，2.5 μg/ml 抗CD3抗体或2.5 ng/ml IL-1β刺激，核抽提物与32P标记的编码NF-AT序列的寡核苷酸孵育，PAGE分离蛋白和核苷酸的复合物，并进行放射自显影，结果表明，与对照组相比，PD98059能部分减少NF-AT的活性。Koike等［7］用25 μmol/L PD98059处理Jurkat细胞，抗TCR抗体刺激，结果发现，NF-AT的活性较对照组降低大约50%，Villalba等［21］用PD98059处理转染有NF-AT质粒的JurkatAg细胞，抗CD3抗体刺激，结果发现，NF-AT的活性较对照组减少77%，这表明ERK1/2信号通路的激活能增加NF-AT的活性。另有研究认为，在T淋巴细胞中NF-AT的活性与ERK1/2信号通路无关。Dietz等［22］用抗肿瘤药甲磺酸伊马替尼处理人的初始T细胞，1μmol/L PHA刺激96 h，结果发现ERK1/2的磷酸化减少，但NF-AT活性并无改变。可见，多数研究表明ERK1/2信号通路的激活能提高NF-AT的活性。

    3.2  AP-1与T淋巴细胞  DOR1/Ju.1细胞是转染Gi蛋白偶联受体DOR1的Jurkat细胞，δ-啡肽是DOR1的促效剂，Hedin等［23］发现在Jurkat细胞中，DOR1能激活ERK1/2，DOR1/Ju.1细胞用PD98059处理后，10-7 mol/L δ-啡肽刺激4 h，EMSA分析显示，PD98059较对照组能明显抑制AP-1的表达。这表明阻断ERK1/2信号通路能抑制AP-1的活性，Budagian等［24］发现细胞外ATP能增加ERK1/2的磷酸化，用50 μmol/L PD98059 处理Jurkat细胞，再用3 mmol/L ATP刺激，结果发现，与对照组相比，PD98059能明显抑制ERK1/2的磷酸化。Jurkat细胞用3 mmol/L ATP处理后，用含有AP-1序列的双链寡核苷酸探针孵育，EMSA分析显示，AP-1的活性明显增加，提示ERK1/2信号通路的激活可能与细胞外ATP介导的AP-1的激活有关。Rio等［5］用PD98059处理Jurkat细胞，抗CD43抗体L10刺激8 h，EMSA检测发现，与对照组相比，PD98059能降低AP-1的活性，提示在Jurkat细胞中，ERK1/2信号通路的激活能提高CD43分子诱导的AP-1的活性。另有研究认为，在T淋巴细胞中AP-1的活性与ERK1/2信号通路无关。Vav蛋白是一种GTP/GDP交换因子，共有Vav1、Vav2、Vav3三种类型，Cao等［25］发现在Vav-1缺陷的T细胞中AP-1的活性明显减少，但ERK1/2的活性却保持不变。可见，多数研究表明ERK1/2信号通路的激活能提高AP-1的活性。

    3.3  NF-κB与T淋巴细胞  Varga等［20］用50 μmol/L PD98059处理EL-4胸腺细胞，2.5 μg/ml 抗CD3抗体刺激，核抽提物用32P标记的编码NF-κB序列的寡核苷酸孵育，PAGE分离蛋白和核苷酸的复合物，并进行放射自显影，结果表明，PD98059较对照组能明显降低NF-κB的活性，这表明ERK1/2信号通路的激活能增加NF-κB的活性。Patrick等［26］用抗CD3/CD28抗体刺激Vav-/-脾脏T细胞，结果发现，与对照组相比，Vav-/-脾脏T细胞中仅有少量的ERK2磷酸化。EMSA检测显示，在对照组中，NF-κB活性随时间增加而增加，而Vav-/-脾脏T细胞中的NF-κB活性几乎不变化，以上结果说明在Vav-/-脾脏T细胞中TCR诱导的ERK1/2和NF-κB的活性都被抑制。Iwashima等［27］发现Shc作为一个衔接分子对TCR诱导的IL-2的产生很重要，与正常的Jurkat细胞相比，在Shc缺陷的Jurkat细胞中，ERK1/2和NK-κB的激活都明显降低。另有研究认为，在T淋巴细胞中NF-κB的活性与ERK1/2信号通路无关。κB基序被称为T cell element distal(TECd)，Matthews等［28］用30 μmol/L PD98059处理转染有TECd- CAT的EL4 NOB-1细胞(胸腺细胞)，10 ng/ml IL-1刺激24 h，结果表明，IL-1能刺激TECd-CAT活性上调5.4倍，但用PD98059预处理后不影响TECd-CAT的活性变化，这表明NF-κB可能不是ERK1/2信号通路的一个靶点。可见，多数研究表明ERK1/2信号通路的激活能提高NF-κB的活性。

    此外，也有报道其他一些转录因子在ERK1/2信号通路对T淋巴细胞的影响中起作用，Gibellini等［29］发现10 ng/ml Tat蛋白能诱导Jurkat CD4+T细胞中的cFos表达上调，预先用PD98059处理Jurkat CD4+T细胞，再用Tat蛋白刺激，结果发现PD98059能抑制cFos的表达，这表明ERK1/2信号通路的激活能促进Tat诱导的cFos的激活。总之，转录因子的调节对ERK1/2信号通路在T淋巴细胞的影响中起重要作用，但其明确机制还有待进一步研究。

    4  结论

    以上研究表明，ERK1/2信号通路的激活能促进T淋巴细胞的活化、增殖并抑制其凋亡，转录因子NF-AT、AP-1和NF-κB可能是ERK1/2信号通路影响T淋巴细胞生物学行为的关键环节。因此，深入研究这些转录因子的作用机制将有助于探明ERK1/2信号通路对T淋巴细胞的影响，并可能为T淋巴细胞相关的免疫性疾病和肿瘤的治疗提供新的策略。

    ［参考文献］

    1  Boulton TG, Nye SH, Robbins DJ, et al. ERKs: a family of proteinserine/threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGF. Cell,1991,65(4):663-675.

    2  Widmann C, Gibosn S, Jarpe MB, et al. Mitogen activated protein kinase: conservation of  a three kinase module from yeast to human. Physiol Rev,1999,79(1):143-180.

    3  Okamoto N, Tezuka K, Kato M, et al. PI3-kinase and MAPkinase signaling cascades in AILIM/ICOSand CD28-costimulated tcells have distinct functions between cell proliferation and IL-10 production. Biochem Biophys Res Commun,2003,310(3):691-702.

    4  Dumont FJ, Staruch MJ, Fischer P, et al. Inhibition of T cell activation by pharmacologic disruption of the MEK1/ERK MAP kinase or calcineurin signaling pathways results in differential modulation of cytokine production. J Immunol,1998,160(6):2579-2589.

    5  Rio R, Rincon M, LaysecaEspinosa E, et al. PKCθ is required for the activation of human T lymphocytes induced by CD43 engagement. Biochem Biophys Res Commun,2004,325(1):133-143.

    6  HughesFulford M, Sugano E, Schopper T, et al. Early immune response and regulation of IL-2 receptor subunits. Cell Signal,2005,17(9):1111-1124.

    7  Koike T, Yamagishi H, Hatanaka Y, et al. A novel ERKdependent signaling process that regulates interleukin-2 expression in a late phase of T cell activation. J Biol Chem,2003,278(18):15685-15692.

    8  Barata JT, Silva A, Branda JG, et al. Activation of PI3K is indispensable for interleukin 7-mediated viability, proliferation, glucose use, and growth of T cell acute lymphoblastic leukemia cell. J  Exp  Med,2004,200(5):659-669.

    9  Sharp LL, Schwarz DA, Bott CM, et al. The influence of the MAPK pathway on T cell lineage. Immunity,1997,7(5):609-618.

    10  Mariathasan S, Ho S, Zakarian A, et al. Degree of ERK activation influences both positive and negative thymocyte selection. Eur J Immunol,2000,30(4):1060-1068.

    11  AcunaCastillo C, Aravena M, LeivaSalcedo E, et al. Tkininogen, a cystatinlike molecule, inhibits ERKdependent lymphocyte proliferation. Mech Ageing Dev,2005,126(12):1284-1291.

    12  Nekrasova T, Shive C, Gao Y, et al. ERK1deficient mice show normal T cell effector function and are highly susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol,2005,175(4):2374-2380.

    13  Yu C, Mao X, Li WX, et al. Inhibition of the PI3K pathway sensitizes fludarabineinduced apoptosis in human leukemic cells through an inactivation of  MAPKdependent pathway. Biochem Biophys Res Commun,2005,331(2):391-397.

    14  Islam Z, Pestka JJ. LPS priming potentiates and prolongs proinflammatory cytokine response to the trichothecene deoxynivalenol in the mouse. Toxicol Appl Pharmacol,2006,211(1):53-63.

    15  Betito S, Cuvillier O. Regulation by sphingosine 1-phosphate of  bax and bad activities during apoptosis in a MEKdependent manner. Biochem Biophys Res Commun,2006,340(4):1273-1277.

    16  Wispriyono B, Matsuoka M, Igisu H, et al. Effects of pentachlorophenol and tetrachlorohydroquinone on mitogenactivated protein kinase pathways in jurkat cells. Environ Health Perspect,2002,110(2):139-143.

    17  LiWeber M, Treiber MK, Giaisi M, et al. Ultraviolet irradiation suppresses T cell activation via blocking TCRMediated ERK and NF-B signaling pathways. J Immunol,2005,175(4):2132-2143.

    18  Manjula N, Gayathri B, Vinaykumar KS, et al. Inhibition of MAP kinases by crude extract and pure compound isolated from Commiphora mukul leads to down regulation of TNFalpha, IL-1beta and IL-2. Int Immunopharmacol,2006,6(2):122-132.

    19  Kataoka T, Budd RC, Holler N, et al. The caspase-8 inhibitor FLIP promotes activation of NFkappaB and Erk signaling pathways. Curr Biol,2000,10(11):640-648.

    20  Varga G, Dreikhausen U, Kracht M, et al. Molecular mechanisms of T lymphocyte activation: convergence of T cell antigen receptor and IL-1 receptor-induced signaling at the level of IL-2 gene transcription. Int Immunol,1999,11(11):1851-1862.

    21  Villalba M, Hernandez J, Deckert M, et al. Vav modulation of the Ras/MEK/ERK signaling pathway plays a role in NFAT activation and CD69 up-regulation. Eur J Immunol,2000,30(6):1587-1596.

    22  Dietz AB, Souan L, Knutson GJ，et al. Imatinib mesylate inhibits Tcell proliferation in vitro and delayedtype hypersensitivity in vivo. Blood,2004,104(4):1094-1099.

    23  Hedin KE, Bell MP, Huntoon CJ, et al. Gi proteins use a novel beta gammaand rasindependent pathway to activate extracellular signal-regulated kinase and mobilize AP-1 transcription factors in jurkat lymphocytes. J Biol Chem,1999,274(28):19992-20001.

    24  Budagian V, Bulanova E, Brovko L, et al. Signaling through P2X7 receptor in human T cells Involves p56lck, MAP kinases, and transcription factors AP-1 and NF-κB. J Biol Chem,2003,278(3):1549-1560.

    25  Cao Y, Janssen EM, Duncan AW, et al. Pleiotropic defects in TCR signaling in a Vav-1-null    Jurkatcell line. EMBO J,2002,21(18):4809-4819.

    26  Patrick S, Costello, Alice E,et al. The Rhofamily GTP exchange factor Vav is a critical transducer of T cell receptor signals to the calcium, ERK and NF-κB pathways.  Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(6):3035-3040.

    27  Iwashima M, Takamatsu M, Yamagishi H, et al. Genetic evidence for Shc requirement in TCRinduced cRel nuclear translocation and IL-2 expression. Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(7):4544-4549.

    28  Matthews JS, O'Neill LA. Distinct roles for p42/p44 and p38 mitogen-activated protein kinases in the induction of IL-2 by IL-1. Cytokine,1999,11(9):643-655.

    29  Gibellini D, Re MC, Ponti C, et al. Extracellular tat activates cfos promoter in low serumstarved CD4+ T cells. Br J Haematol,2001,112(3):663-670.

   *基金项目：国家自然科学基金资助项目(30471635)；广东省自然科学基金资助项目(04010451，5006033)；暨南大学引进优秀人才科研启动基金(51204058)

    作者单位： 510632 广东广州，暨南大学组织移植与免疫中心（△通讯作者）

　 (编辑：唐  城)