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【摘要】 目的 观察肢体缺血再灌注所致脑损伤中NO的变化，探讨NO在损伤中的作用。方法 Wistar大鼠随机分成对照组、再灌4 h组、再灌12 h组和再灌24 h组。复制大鼠肢体缺血再灌损伤模型，测定各组大鼠脑组织中NO、丙二醛（MDA）含量，用免疫组织化学方法和Western-blot方法观察各组脑组织诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达变化。结果 各组随再灌时间的延长，MDA含量和NO含量逐渐升高，再灌24 h组为表达高峰，差异有显著性（P<0.01）。结论 MDA、NO在肢体缺血再灌注所致脑损伤中起重要作用。
【关键词】 缺血再灌注；脑损伤；一氧化氮；丙二醛
Study on nitric oxide in brain injuried by hind limbs ischemia-reperfusion in rats
LI Ping.Leshan City,Wutong-qiao Dongfeng Hospital,Leshan 614802,China
［Abstract］ Objective To evaluate the possible role of nitric oxide （NO） in development of brain injury after hind limbs ischemia-reperfusion （LIR）.Methods Wistar rats were divided into four groups: control group，reperfusion 4 h group，reperfusion 12 h group，and reperfusion 24 h group.The content of malondialdehyde （MDA） and NO in the brain were detected.The immunohistochemical and western-blot method were used to detect the level in the expression of iNOS.Results The content of MDA increased in brain tissue.The immunohistochemical and western-blot analysis showed that the level in the expression of iNOS reduced（P＜0.01）.Conclusion MDA and NO play an important role in brain injury following LIR.
［Key words］ limbs ischemia-reperfusion;brain injury;nitric oxide;malondialdehyde
肢体缺血再灌注可引发脑损伤，且iNOS-NO参与脑损伤过程［1］，但其确切机制还未完全阐明。以往研究表明，在脑缺血再灌注后期，iNOS介导的NO延迟性增高，过量NO可增加自由基生成，Ca2+内流，加重脑损伤。同时NO参与谷氨酸的神经毒性作用，给予谷氨酸受体拮抗剂可降低由脑缺血兴奋氨基酸毒性作用引起的梗死体积。因此，深入探讨肢体缺血再灌注后脑组织中iNOS-NO关系具有重要的临床意义。本实验在大鼠肢体缺血再灌注损伤模型基础上，观察脑组织中iNOS-NO的变化，探讨肢体缺血再灌注后脑损伤中iNOS-NO的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 清洁级健康雄性Wistar大鼠40只，体重200~250 g，购自河南医学动物中心，常规饲养。NO、MDA含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。羊抗鼠iNOS多克隆抗体（Santa Cruz产品）、即用型ElivisonTM plus试剂盒和Western-blot有关试剂购自华美生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组和模型复制 随机将大鼠分为对照组、再灌4 h组、再灌12 h组和再灌24 h组，每组10只。采用常规方法复制大鼠肢体缺血再灌损伤模型［2］，乙醚浅麻醉下以橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部，阻断血流4 h后松解，恢复血流灌注4、12、24 h。迅速断头取脑，液氮速冻，-70 ℃储藏，备用。对照组除不结扎肢体外，操作同其余缺血组动物。
1.2.2 脑组织学检查 各组大鼠恢复血流再灌注后，经心脏主动脉插管灌注固定液（40 g/L多聚甲醛，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液配制）后取脑，常规石蜡包埋并切片，进行HE染色，光学显微镜下观察脑组织切片。
1.2.3 测定脑组织中NO、MDA含量 取脑组织制备组织匀浆，NO、MDA含量测定均按照试剂盒说明进行。
1.2.4 脑组织iNOS的免疫组化检测 脑组织石蜡切片，常规脱蜡及脱水［3］。按照即用型ElivisonTM plus试剂盒说明书进行操作，iNOS一抗稀释浓度为1∶100，结果用计算机Motc Med 6.0数码医学图像分析系统进行分析。
1.2.5 Western-blot检测iNOS表达 将各组动物断头快速取脑（额基平面后［4］），按照文献［5］方法进行脑组织蛋白的制备。样品加样于150 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶，电泳分离，电转移至PVDF膜，在阻断非特异性结合后，加诱导型一氧化氮合酶抗体（1∶500），4 ℃过夜，二抗孵育1 h（1∶1000），DAB显色。
1.2.6 统计学方法 数据以（x±s）表示，用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，单因素方差分析进行组间比较，有显著差异者用最小显著法（LSD）进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 后肢缺血再灌注后各组脑组织NO、MDA含量 缺血再灌注各组随再灌时间的延长，MDA含量逐渐升高，组织损伤加重，再灌24 h后MDA含量达最高，其中缺血再灌注各组与正常组比较，差异有显著性意义（P<0.01）。缺血再灌注各组随再灌时间的延长，NO逐渐升高，再灌24 h与对照组比较提高46.9%，脑组织损伤加重。见表1。
2.2 后肢缺血再灌注后各组脑组织iNOS免疫组化染色的改变 后肢缺血再灌注后随再灌时间的延长，表达呈逐渐上升趋势，差异显著，且再灌24 h达高峰。阳性信号主要分布海马区、中脑红核区等部位的神经元细胞，对照组仅见少量表达。对染色结果进行图像分析，结果见图1。表1 后肢缺血再灌注后各组脑组织MDA和NO含量变化注：与对照组比较，*P＜0.05，△P＜0.01
2.3 后肢缺血再灌注后各组脑组织iNOS表达的改变 Western-blot检测结果显示：后肢缺血再灌注后各组脑组织样品为83-175kD，即130 kD处，缺血再灌注各时间点样品均显示出一条iNOS特异性蛋白条带。缺血4 h再灌4 h组、缺血4 h再灌12 h组、与缺血4 h再灌24 h组相比特异性蛋白带较浅，随再灌注时程的延长，iNOS表达明显增高，差异显著，并在24 h达高峰 （见图2）。
3 讨论
研究表明，严重的肢体缺血再灌注后可导致肺、肾、心、脑等重要器官的损伤。研究证实，肢体缺血再灌注后，自由基引发脂质过氧化反应，释放蛋白酶消化和分解弹性蛋白和胶原蛋白，造成组织损伤和血管通透性增加［6］。MDA为氧自由基诱导脂质过氧化反应的主要代谢产物，其含量间接反映脑组织氧自由基的生成量。本实验发现，脑组织MDA含量随再灌时间的延长明显升高，且再灌24 h组MDA含量达最高，反映出缺血再灌注后脑内脂质过氧化反应增强。再灌注后脑内大量氧自由基生成可能作为脑组织损伤的主要因素之一。
NO作为一个细胞间及细胞内信息物质，在缺氧、干扰素等刺激下，进行转录并合成iNOS，产生大量NO具有清除自由基，诱导细胞凋亡等作用［7］。本实验发现，再灌注后各组脑组织NO含量明显升高，免疫组织化学及Western-blot检测结果提示，在脑组织海马区、中脑红核区iNOS表达上调，反映出缺血再灌注后，随再灌时间的延长，iNOS合成增加，导致大量神经元NO产生增强。研究表明［8］，组织缺血再灌时，大量兴奋性神经递质由突触前神经元释放，激活突触后受体（NMDA、AMPA、Kainate），引起细胞内钙增加，一氧化氮合酶兴奋，产生大量神经元NO，细胞内游离脂肪酸和自由基增加，导致水肿和更多钙内流，三磷酸腺苷贮存耗尽，膜泵衰竭，神经元死亡。本实验中肢体缺血再灌注后导致NO产生增强，谷氨酸大量堆积可能在其中起重要作用。
【参考文献】
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作者单位：614802 四川乐山，乐山市五通桥东风医院