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【关键词】 胃癌
［Abstract］ Objective To investigate the effect of cyclooxygenase inhibitor on tumor metastasis, tumor angiogenesis and vascular endothelial growth factor （VEGF） of orthotopic implanted human gastric carcinoma in non-obesity diabetes （NOD） severe combined immune deficiency （SCID） mice. Methods Human gastric cancer SGC-7901 were orthotopically implanted into the stomach of the NOD SCID mice. Forty mice were randomly divided into two groups which received either intravenous injections of 0.9% NaCl solution （0.9% NaCl solution group） of 50mg/（kg·d） Nimesulide （Nimesulide group） twice weekly for two weeks. Mice were sacrificed five weeks after implantation. Tissues from stomach and other organs were obtained for histopathological evaluation. The intratumoral microvessel density （MVD） and VEGF protein expression in tumor were evaluated immunohistochemically. Results The tumor metastasis rates were 18/20 in 0.9% NaCl solution group and 5/20 in Nimesulide group （P<0.05）. MVD was 9.8±3.9 in 0.9% NaCl solution group and 4.4±2.4 in Nimesulide group （P<0.05）. VEGF protein expression was 90% in 0.9% NaCl solution group and 25% in Nimesuli group （P<0.05）. Conclusion Nimesuli can inhibit the metastasis or gastric cancer through inhibiting tumor VEGF expression, and tumor angiogenesis with no obvious anticoagulant activity.
［Key words］ Nimesulide; stomach neoplasms; neoplasm metastasis; angiogenesis; vascular endothelial growth factor
肿瘤转移是肿瘤致死的关键因素［1］。目前已发现，血管内皮生长因子（VEGF）可促进肿瘤血管生成。抑制VEGF可抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移［2］。体外实验发现，环氧化酶抑制剂尼美舒力可抑制VEGF，从而抑制血管内皮细胞增殖和血管生成。本研究用人胃癌组织原位移植非肥胖性糖尿病（NOD）重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠建立移植模 型，旨在探讨尼美舒力对胃癌血管生成和转移的抑制作用，为其抗肿瘤转移的临床应用提供理论基础。
1 资料与方法
1.1 主要试剂 羊抗人CD34抗体和VEGF抗体由哈尔滨医科大学伊达股份有限公司（哈尔滨）提供。
1.2 动物模型 健康雄性NOD SCID小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，鼠龄6～7周，体重20～25g。裸鼠皮下传代的人胃癌细胞系SGC7901由上海市肿瘤研究所提供，移植时处死荷瘤裸鼠，皮肤消毒，取下肿瘤，浸入0.9%氯化钠溶液中。采用人胃癌组织原位移植NOD SCID小鼠建立胃癌原位移植模型，将动物麻醉后，暴露胃壁，在胃大弯中部用剪刀损伤胃浆膜层，将人胃癌组织块（约150mg）缝在损伤处，缝合腹壁和皮肤［3］。 模型制作后，将小鼠分为尼美舒力组（n=20）和0.9%氯化钠溶液组（n=20）,术后第1周，尼美舒力组静脉注射尼美舒力，每次50mg/kg （0.9%氯化钠溶液稀释至100μl）,每周2次，共2周；0.9%氯化钠溶液组静脉注射0.9%氯化钠溶液，每次100μl，每周2次，共2周。每周测NOD SCID小鼠体重2次。
1.3 标本收集和病理学检查 第5周末处死所有小鼠。10%甲醛固定肿瘤组织标本，石蜡包埋后常规切片，H-E染色，光学显微镜下观察病理变化，观察肿瘤转移情况。
1.4 肿瘤平均微血管密度测定 4μm厚石蜡切片脱蜡后，用免疫组化Envision二步法检测CD34，一抗浓度为1：300，以血管内皮细胞呈棕黄色为阳性。参照Weidner法，计算肿瘤平均微血管密度，先在低倍镜（×100）下全面观察切片以确定肿瘤内血管密度量高处。再在高倍镜（×200）下，记录5个视野内的微血管数，取其平均数作为该动物的平均微血管密度值。
1.5 肿瘤组织VEGF蛋白表达测定 4μm厚石蜡切片脱蜡后，用免疫组化Envision二步法检测VEGF表达，一抗浓度为1：60，以肿瘤细胞胞质内呈棕黄色颗粒为阳性染色。阳性染色细胞<10%为阳性（+），≥10%为（++），肿瘤细胞胞质内未见棕黄色颗粒为阴性（-）。
1.6 统计学方法 应用χ2精确检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 尼美舒力对人胃癌移植模型的作用 人胃癌SGC-7901组织原位移植NOD SCID小鼠后第6周，胃癌移植瘤均原位生长良好，肿瘤向胃腔内突出，质硬脆。光学显微镜下见肿瘤组织为低分化腺癌，浸润黏膜层、黏膜下层和肌层。对肿大淋巴结与可疑转移脏器行病理学检查，发现淋巴结转移以胃周、肠系膜和主动脉旁为主，各脏器转移以肝脏最为常见，其次为肺、胰、脾等脏器。 0.9%氯化钠溶液组中18只小鼠有肿瘤转移（18/20），分别为淋巴转移18只，肝脏转移15只，其他脏器（胰、脾、肺等）转移13只；但尼美舒力组中仅5只有肝转移（5/20），两组间差异有显著性（P<0.05）。
2.2 尼美舒力对人胃癌微血管密度的抑制作用 CD34在血管内皮细胞膜和细胞质染色，出现管腔结构。0.9%氯化钠溶液组原位移植瘤血管生成明显，平均微血管密度为9.8±3.9,尼美舒力组为4.4±2.4，两组间差异有显著性（P<0.05）。
2.3 尼美舒力对人胃癌组织VEGF的影响 VEGF阳性染色位于细胞胞质内，0.9%氯化钠溶液组VEGF阳性表达明显高于尼美舒力组（P<0.05）（见表1）。表1 免疫组化检测NOD SCID小鼠胃癌组织VEGF阳性表达 注：经χ2检验，P<0.05
3 讨论
有关肿瘤血管生成和转移已受到关注。抗血管生成治疗对改善胃癌患者临床疗效和预后有重要意义［3，4］。近年研究表明，还氧化酶（COX）通过前列腺素途径促进VEGF的表达上调。VEGF是一种高度特异和高效的生长因子，对于人的某些正常生理功能和某些病理过程（如肿瘤的生长及转移）起重要作用。COX抑制剂明显抑制VEGF等多种促血管生成因子的表达，使肿瘤血管生成减少。 本研究用人胃癌SGC-7901组织原位移植NOD SCID小鼠建立胃癌移植模型，与人类胃癌转移相似，肿瘤转移率高，是胃癌转移研究的理想模型。本研究发现，人胃癌组织原位移植NOD SCID小鼠，经环氧化酶抑制剂尼美舒力治疗后，显著抑制肿瘤转移，与文献报道一致。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的条件。肿瘤生长到2～3mm3时，由于组织缺血缺氧，肿瘤细胞产生的肿瘤血管生成抑制因子表达下降，微血管大量生成。肿瘤细胞产生的VEGF是重要的促血管生长因子，通过与受体VEGFR1、VEGFR2结合，具有特异性促进血管内皮细胞增殖和迁移、增高血管通 透性的作用，在肿瘤生长与转移中起重要作用［3］。 CD34是微血管内皮的标记，CD34染色可反映微血管密度。本研究发现，尼美舒力组的肿瘤平均微血管密度明显低于对照组，表明尼美舒力对肿瘤新生血管生成具有显著抑制作用。肿瘤新生血管的大量形成增加肿瘤细胞转移的机会，新生血管通透性较高，增加肿瘤转移，而尼美舒力通过抑制肿瘤血管生成对胃癌等实体瘤具有抗转移作用［5］。 人胃癌原位移植NOD SCID小鼠，经尼美舒力治疗后，明显抑制肿瘤细胞VEGF。有研究表明，VEGF表达与胃癌患者术后肿瘤转移、复发和预后相关。胃癌患者VEGF表达与微血管密度的关系，研究显示肿瘤细胞内VEGF阳性表达的微血管密度明显高于阴性者。肿瘤细胞通过分泌VEGF等促血管生长因子，促进肿瘤新生血管生成，从而使肿瘤组织内血管增多，血管通透性增高，因此在肿瘤转移中起重要作用，尼美舒力通过抑制VEGF表达和肿瘤新生血管形成，对胃癌等肿瘤具有抗转移作用。
【参考文献】
1 Fondevila C,Metges JP,Fuster J,et al.p53 and VEGF expression are independent predictors of tumour recurrence and survival following curative resection of gastric cancer.Br J Cancer,2004,90:206-215.
2 Tsujitani S, Saito H,Maeta Y,et al.Neoangiogenesis in patients with gastric carcinoma in relation to the expression or vascular endothelial growth factor and thymidine phosphorylase.Anticancer Res,2004,24:1853-1859.
3 Sun YJ，Tang XM,Half E,et al.Cyclooxygenase-2 over expression reduces apoptotic susceptibility by inhibiting the cytochrome-C-dpendent apoptotic pathway in human colon cancer cells.Cancer Res,2002,62（21）:6323-6328.
4 Koki AT,Masferrer JL.Celecoxib:a specific COX-2 inhibitor with anti-cancer properties.Cancer Control,2002,9:28-35.
5 Leahy KM,Ornberg RL,Wang Y,et al.Cyclooxygenase-2 inhibition by celecoxib reduces proliferation and induces apoptosis in angiogenic endothlial cells in vivo.Cancer,2002,62（3）:625-631.
作者单位：150001 黑龙江哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一临床医学院