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【摘要】 目的 探讨甲状腺癌患者糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（GPI-PLD）的活性变化，为甲状腺癌患者的诊断提供依据。方法 利用具有糖基化磷脂酰肌醇（GPI） 结构的胎盘碱性磷酸酶（PLAP）做底物,通过TX-114分相,定量检测外周血单个核细胞和血浆中GPI-PLD活性，并采用荧光定量PCR外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA水平，分析其表达量与甲状腺癌之间的关系。结果 甲状腺癌患者外周血单个核细胞和血浆中GPI-PLD酶活性分别为（24.15±2.33）%和（29.71±1.52）%，明显低于正常外周血中GPI-PLD酶活性（P＜0.001），且甲状腺癌患者单个核细胞GPI-PLD活性仅为其血浆中酶活性水平的81.29%，二者之间差异有显著性（P<0.05）；甲状腺癌患者外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA表达平均值为（0.46±0.17）×103copy/ng total RNA，明显低于正常人外周血单个核细胞中的表达水平（1.35±0.41）×103copy/ng total RNA （P＜0.001）。结论 GPI-PLD在甲状腺癌患者中活性及表达明显降低，有可能作为甲状腺癌诊断的指标之一。
【关键词】 甲状腺癌；糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D；荧光定量PCR
The clinical significance of GPI-PLD expression in thyroid carcinoma diagnosis
HAO Shu-hua, JIANG Ze-hua.The People’s Hospital of Yiyang City, Hunan 413001，China
［Abstract］ Objective To discuss the activity changes of glycation phosphatidylinositol-specific phospholipase D （GPI-PLD） in thyroid carcinoma patients and provide a basis for judging the prognosis.Methods Advanced GPI structure of placental alkaline phosphatase （PLAP） substrate was used. Through TX-114 phase, the quantitative of peripheral blood mononuclear cells and plasma GPI-PLD activity was detected. FQ-PCR was used to detect GPI-PLD mRNA level of peripheral blood mononuclear cells and analyze their expression and the relationship between thyroid carcinoma.Results The activity of peripheral blood mononuclear cells and plasma GPI-PLD in thyroid carcinoma patients were （24.15 ± 2.33）% and （29.71 ± 1.52）%, which were significantly lower than those in normal person （P<0.001）. The average expression of GPI-PLD mRNA in peripheral blood mononuclear cells of thyroid carcinoma patients was （0.46±0.17）×103 copy/ng total RNA, which was significantly lower than that in the normal person （1.35±0.41）×103copy/ng total RNA （P<0.001）.Conclusion The activity and expression of GPI-PLD in thyroid carcinoma patients decreases significantly, which maybe possible to determine thyroid carcinoma as one indicator.
［Key words］ thyroid carcinoma; GPI-PLD; fluorescent quantitation PCR
甲状腺癌是头颈部常见恶性肿瘤，占全身肿瘤的1%～2%，可发生于任何年龄，30～40岁为发病高峰期，女性多见，潜伏期长，生长缓慢，转移早。在地方性结节性甲状腺肿流行区，甲状腺癌特别是低分化甲状腺癌的发病率也很高［1］。因此，全面阐明甲状腺癌的发病机制,对于临床诊断和治疗十分重要。研究发现一些糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定蛋白质已经成为一些肿瘤的标志物,如GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）［2］和癌胚抗原（CEA）等［3］。目前在人体内经分子生物学证实的只有糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（glycosylphosphatidylinositol specific phospholipase D,GPI-PLD）能在特定的情况下特异性水解GPI锚定蛋白中的肌醇磷酸酯键,释放细胞质膜上的锚定蛋白［4］。本研究探讨了甲状腺癌患者外周血血浆和单个核淋巴细胞中GPI-PLD的活性及GPI-PLD在外周血单个核细胞中的表达水平，为进一步分析GPI-PLD作为甲状腺癌患者诊断判断指标提供了依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集我院2002年3月-2008年6月之间的90例甲状腺癌住院患者外周血，采集后放置于-70℃保存备用，同时收集正常人外周血180例。所有甲状腺癌患者均经病理确诊。
1.2 血浆中GPI-PLD活性测定 按照文献［5］报道的方法进行，待测血清用量为 20μl，每个待测管同时做6个平行管，取平均值。
1.3 外周血单个核细胞GPI-PLD酶活性水平测定 用购买自Sigma公司的完整GPI结构的胎盘碱性磷酸酶（PLAP）为底物，通过TX-114分相,定量检测转染细胞中GPI-PLD活性（活性单位为释放GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶的百分率）。具体步骤按已经报道的方法进行［4］。GPI-PLD酶活性计算公式为：
GPI-PLD酶活性=［（待测组W管吸光度值×待测组水相体积）/（待测组T管吸光度值×待测组总体积）-（对照组W管吸光度值×对照组水相体积）/（对照组T管吸光度值×对照组总体积）］×100%
1.4 荧光定量PCR检测 用于实时定量PCR（RT-PCR）分析的引物由Oligo Primer Analysis软件（5.0版）设计；为避免基因组DNA的污染，在设计引物和探针的时候尽量避免扩增基因组DNA，设计的引物至少跨越1个内含子。收集全血，分离淋巴细胞后，用TRIzol试剂提取总RNA，取2μl进行荧光定量PCR检测。GPI-PLD引物为：forward,5’-CCCAGCCTGAGCAACAAAG-3’；Reverse, 5’-TTCCTCGCCTCTCACCGTC-3’;Probe,5’-AAACTGAACGTGGAGGCGGCCAAC-3’，以GAPDH为内参照。反应条件：45℃ 90min，95℃ 10min, 95℃ 15s，55℃ 50s，共40个循环。每一例样本反应结束后由计算机自动计算并读出定量结果Ct 值（threshold cycle）。
1.5 统计学分析 所有数据采用均数±标准差（x±s）表示,采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理,数据比较采用t检验,以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 正常人及甲状腺癌患者外周血单个核细胞中GPI-PLD酶活性水平 检测了180名正常人和90例甲状腺癌患者，其外周血单个核细胞中GPI-PLD酶活性分别为（41.82±1.43）%（图1A）和（24.15±2.33）%（图1B），比较二者酶活性，发现正常人群中外周血单个核细胞中GPI-PLD酶活性明显高于甲状腺癌患者外周血单个核细胞中GPI-PLD酶活性（P＜0.001）。
2.2 正常人及甲状腺癌患者外周血血浆中GPI-PLD酶活性水平 同时，检测了180名正常人和90例甲状腺癌患者，其血浆中GPI-PLD活性水平分别为（41.91±1.52）%（图2A）和（29.71±1.32）%（图2B），其中甲状腺癌患者外周血血浆中GPI-PLD酶活性水平明显低于正常人群外周血血浆中GPI-PLD酶活性水平（P＜0.001）。
进一步分析发现，甲状腺癌患者单个核细胞GPI-PLD活性仅为正常人血浆中酶活性水平的81.29%，二者之间差异有显著性（P<0.05），但正常人单个核细胞和血浆中GPI-PLD的酶活性水平差异无显著性（P>0.05）。
2.3 正常人和甲状腺癌患者外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA水平 随机选取上述180名正常人中选取30例和从90例甲状腺癌患者中选取37例单个核细胞的标本进行检测，其外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA表达平均值分别为（1.35±0.41）×103copy/ng total RNA和（0.46±0.17）×103copy/ng total RNA，甲状腺癌患者外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA表达水平显著性低于正常人外周血单个核细胞中的GPI-PLDmRNA表达水平（P＜0.001）（图3）。
3 讨论
GPI-PLD能选择性地水解GPI锚定蛋白中的肌醇磷酸酷键，释放出锚定蛋白质，影响GPI锚定蛋白质的表达和生物学功能［6］。一些GPI锚定蛋白质（如CD55、CD59等）是重要的免疫分子，T淋巴细胞的活化和增殖也涉及到GPI锚定蛋白质。GPI-PLD有可能通过影响肿瘤细胞膜表面GPI锚定蛋白的水解释放，导致肿瘤细胞失出对补体杀伤作用的抵抗，增强杀伤性T淋巴细胞及吞噬细胞等对肿瘤细胞的清除［7］。
笔者研究发现在甲状腺癌患者的外周血中，GPI-PLD酶活性与正常人群相比明显下降（P＜0.001），其活性与正常人GPI-PLD酶活性相比，下降了将近30%。进一步研究发现甲状腺癌患者外周血单个核细胞中的GPI-PLD酶活性与正常人群相比，也是明显降低的（P＜0.001），仅为正常人血浆中酶活性水平的81.29%，这些都可能与甲状腺癌患者杀伤性T淋巴细胞及吞噬细胞等对肿瘤细胞的杀伤作用低下有关。
荧光定量PCR检测发现甲状腺癌患者外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA表达量为（0.46±0.17）×103copy/ng total RNA，而正常人外周血单核细胞中GPI-PLD mRNA表达量为（1.35±0.41）×103copy/ng total RNA，显著性高于甲状腺癌患者中的表达水平（P＜0.001）。
因此，通过上述研究，笔者认为甲状腺癌外周血血浆中GPI-PLD活性低下、单个核细胞中GPI-PLD表达量下降。外周血血浆和单个核胞中GPI-PLD的活性及GPI-PLD在外周血单个核细胞中的表达水平，可以作为甲状腺癌的诊断指标之一。
【参考文献】
1 Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM.Lung cancer. N Engl J Med,2008,359（13）:1367-1380.
2 Screaton RA,DeMarte L,Dráber P,et al. The specificity for the differentiation blocking activity of carcinoembryonic antigen resides in its glycophosphatidyl-inositol anchor. J Cell Biol,2000,150（3）:613-626.
3 Nicholson TB, Stanners CP. Identification of a novel functional specificity signal within the GPI anchor signal sequence of carcinoembryonic antigen. J Cell Biol,2007,177（2）:211-218.
4 Watanabe K, Bianco C, Strizzi L, et al.Growth factor induction of Cripto-1 shedding by glycosylphosphatidylinositol-phospholipase D and enhancement of endothelial cell migration.J Biol Chem,2007,282（43）:31643-31655.
5 唐建华,李文凯.血清糖基化磷脂酞肌醇特异性磷脂酶D的检测.中南大学学报（医学版）,1999,24（2）:119-122.
6 Kiachopoulos S, Bracher A, Winklhofer KF, et al.Pathogenic mutations located in the hydrophobic core of the prion protein interfere with folding and attachment of the glycosylphosphatidylinositol anchor.J Biol Chem,2005,280（10）:9320-9329.
7 Paulick MG, Wise AR, Forstner MB,et al. Synthetic analogues of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins and their behavior in supported lipid bilayers. J Am Chem Soc,2007,129（37）:11543-11550.
（编辑：邓 锋）
作者单位：413001 湖南益阳，益阳市人民医院